G - RWTH Aachen University

Material und Methoden 24
2.2.1.5.2 Plasmid Maxi-Präparation
Zur Isolierung großer Plasmidmengen (z.B. für Transfektionsversuche) wurde
das EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) entsprechend den Vorgaben des Her-
stellers verwendet. Mit Hilfe dieses Kits konnten üblicherweise 500-1000 �g
hochreine Plasmid-DNA aus einer 250 ml E. coli-Kultur in LB mit 100 mg/l Am-
picillin isoliert werden.
2.2.1.6 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Für analytische Zwecke oder zur Herstellung rekombinanter DNA-Konstrukte
wurden Plasmide mit verschiedenen Restriktionsenzymen (New England Bio-
labs, NEB) entsprechend den Angaben und unter Verwendung der Puffersys-
teme des Herstellers gespalten. Dabei wurden jeweils 1-2 Units Enzym/μg DNA
eingesetzt und für mindestens eine Stunde bei 37°C inkubiert. In einigen Reak-
tionen erfolgte nach Angaben des Herstellers die Zugabe von Rinderserumal-
bumin (BSA, Endkonzentration 0,1 mg/ml). Nach Ablauf der Reaktion wurde der
Ansatz gelelektrophoretisch aufgetrennt.
2.2.1.7 Ligation von DNA-Fragmenten
DNA-Fragmente wurden mit dem pCR ® 2.1-TOPO ® Vector der Firma Invitrogen
und dem pGL2-Vektor (Luziferasevektor) der Firma Promega ligiert.
2.2.1.7.1 TOPO ® -Ligation von DNA
Die mit Taq-Polymerase amplifizierten Promotorfragmente wurden zunächst mit
Hilfe des TOPO ® -TA-Cloning-Kits entsprechend den Herstellerangaben in den
pCR ® 2.1-TOPO ® Vector (Invitrogen) kloniert. Das Plasmid pCR ® 2.1-TOPO ®
wird linearisiert geliefert und besitzt an seinem 3’-Ende einen phosphorylierten
Thymidin-Rest. An diesen ist kovalent eine Topoisomerase mit Ligaseaktivität
gebunden.
Da Taq-Polymerase PCR-Produkte mit Adenosin-Resten am 5’-Ende generiert,
sind diese Amplifikate zum pCR ® 2.1-TOPO ® kompatibel und können von der
Topoisomerase effizient mit dem Vektor ligiert werden.
Die TOPO ® -TA Ligationsansätze wurden in One Shot ® TOP10F’ E. coli-
Bakterien transformiert.