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Material und Methoden 22
2.2.1.2 Agarosegelelektrophorese
Die Auftrennung und Visualisierung von DNA-Fragmenten und genomischer
DNA erfolgte mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese. Je nach der erwarteten
Fragmentlänge wurden 0,5-1,5 % Agarosegele eingesetzt. Da Nukleinsäuren
eine negative Ladung aufweisen, bewegen sie sich im elektrischen Feld gerich-
tet und lassen sich somit ihrer Größe entsprechend auftrennen. Durch die Fär-
bung mit Ethidiumbromid wurden die Nukleinsäurefragmente unter UV-Licht
(254 nm oder 366 nm) sichtbar, da Ethidiumbromid die DNA interkaliert.
Die Agarose (0,5-1,5 %) wurde in TAE-Puffer gelöst und mit 0,0001 Vol. Ethidi-
umbromidlösung (10 mg/ml) versetzt. Vor dem Auftragen erfolgte die Mischung
der DNA-Proben mit 0,2 Vol. 5 x Ladepuffer. Zur Charakterisierung der Banden
wurde zusätzlich ein Größenstandard aufgetragen. Danach erfolgte die Auf-
trennung bei einer konstanten Spannung von 5 V/cm mit TAE als Laufpuffer.
Der 50 x TAE-Puffer add 1 Liter setzte sich aus 242 g Tris (2 mM), 57,1 ml Es-
sigsäure (5,7 % w/v) und 100 ml 0,5 M EDTA pH 8.0 (50 mM) zusammen. Aus
dieser Stammlösung wurde eine 1 x Gebrauchslösung hergestellt.
Für den 5 x DNA-Ladepuffer add 100 ml wurden 50 mg Bromphenolblau-
Natrium (0,05 % w/v), 50 mg Xylencyanol (0,06 % w/v), 34 ml 100 % Glycerol
(30 %) und 20 ml 0,5 M EDTA, pH 8.0 verwendet.
2.2.1.3 Transformation von E. coli-Bakterien
Zur Amplifikation von DNA (Plasmide oder Ligationsansätze) wurden diese zu-
nächst in E. coli transformiert. Dazu wurden kommerziell erhältliche, chemisch
kompetente One Shot ® TOP10F’ E. coli-Bakterien (Invitrogen) verwendet und
entsprechend den Angaben des Herstellers behandelt. Pro Transformationsan-
satz wurde ein 50 µl Aliquot kompetenter Zellen auf Eis aufgetaut, mit 10 ng
eines zirkulären Plasmids oder 3 µl eines Ligationsansatzes versetzt und für 30
Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte ein Hitzeschock für 30 Sekun-
den bei 42°C im Wasserbad. Nach einer zweiminütigen Inkubation auf Eis wur-
de jeder Ansatz zur Regeneration mit 250 µl SOC-Medium versetzt und für eine
Stunde bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Der Transformationsansatz wurde
anschließend auf drei LB-Platten mit 100 mg/l Ampicillin ausplattiert und bei
37°C im Brutschrank über Nacht inkubiert.