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Material und Methoden 15 Quelle: Invitrogen Abb. 2: pCR ® 2.1-TOPO ® -Vektor der Firma Invitrogen mit einer Länge von 3,9 kb. Darge- stellt ist die Sequenz, die die TOPO ® Cloning site umgibt, sowie verschiedene Schnittstellen für Restriktionsenzyme. Der Pfeil markiert den Transkriptionsstart für die T7-Polymerase. Zur Analyse der Promotoraktivität von DNA-Fragmenten wurden Luziferase- Reportergenkonstrukte generiert. Hierzu wurden die zu untersuchenden Frag- mente standardisiert über die XhoI- und KpnI-Schnittstellen in den pGL2-Basic Vector (Promega, Abb. 3) kloniert. Dieser umfaßt 5598 bp und enthält ein Luzi- ferase-Reportergen (luc), vor dessen 5’-Ende mehrere Restriktionsschnittstellen zur Einklonierung von DNA-Fragmenten inseriert wurden.
Material und Methoden 16 Quelle: Promega, Technical Resources; Reporter Vectors Abb. 3 : pGL2-Basic Vector mit einer Länge von 5598 bp und diversen Schnittstellen für Restriktionsenzyme (Multiple cloning region: Basen 1-53) Zur Kontrolle der Transfektionseffizienz wurde ein pCMV-ß-Gal-Plasmid einge- setzt. Dieses exprimiert das ß-Galaktosidase-Gen unter Kontrolle eines CMV- Promotors. Zum Auffüllen von Transfektionsansätzen auf eine konstante Gesamt-DNA Menge von 5 µg wurde das Plasmid pBluescript der Firma Stratagene verwen- det. 2.1.5 Enzyme Restriktionsenzyme Aflll NEB EcoRI NEB KpnI NEB PSTI NEB XhoI NEB Weitere Enzyme T4-DNA-Ligase NEB RNase A Sigma
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