Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck
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4. Diskussion 83 4.5 BP230-Epitopmapping Die indirekte Immunfluoreszenz mit rekombinanten Zellen zur Bestimmung von anti-BP230- Antikörpern in Seren von BP-Patienten stellt eine angemessene Ausweichmöglichkeit zu den bisher verfügbaren ELISA dar (Kromminga et al., 2000, Yoshida et al., 2006). Die Grundgesamtheit der anti-BP230-Antikörper konnte allerdings anhand des BP230-Voll- Längen-Proteins nicht hinreichend erfasst werden. Es wurde davon abgesehen, das Polypeptid in einem anderen System in einer höheren Konzentration einzusetzen, weil es dazu hätte aufgereinigt werden müssen und möglicher Weise seine authentische Konformation verloren hätte. In der Literatur ist bisher nicht beschrieben, dass konformationelle Epitope und Modifikationen des BP230 eine entscheidende Rolle spielen. Aus diesem Grund sollte zur Messung aller linearen Epitope auf BP230 eine feinmaschige Kartierung der Voll-Länge durchgeführt werden. Zwölf Plasmide, die für unterschiedliche Teilbereiche von BP230 codierten, wurden in Bakterien exprimiert und die rekombinanten Proteine aufgereinigt. Durch diese Eingrenzung sollte die analytische Sensitivität des Tests gesteigert werden. Die Polypeptide wurden denaturierend aufgereinigt, wodurch eine Kopplung an einen GST-Tag nicht erforderlich war. Der stattdessen verwendete His-Tag war mit 1,1 kD gegenüber dem GST-Tag vergleichsweise klein (24 kD) und nicht bakteriellen Ursprungs, womit immunogene Eigenschaften des Tags weitestgehend ausgeschlossen werden konnten. Für den immunologischen Test wurden die Polypeptide in einer SDS-PAGE separiert und im Westernblot eingesetzt. Auf diese Weise konnte ein Reinheitsgrad von über 95% bezogen auf das einzelne Polypeptid erreicht werden. Für die Untersuchung der Antikörperreaktion gegen die Teilbereiche von BP230 stand das bereits in der Studie im IFT verwendeten Kollektiv aus 49 Seren von BP-Patienten, 11 Seren von PG-Patienten, 16 von PV-Patienten und 94 Seren von gesunden, jungen Blutspendern zur Verfügung. Mit dem Fragment BP230-C3 konnten in 32 Seren anti-BP230-Antikörper nachgewiesen werden. Das entspricht den bisher in der Literatur veröffentlichen Daten (Abbildung 40). Die Antikörper in vier weiteren Seren waren gegen Epitope außerhalb dieses Bereichs gerichtet und waren eventuell unspezifisch für das bullöse Pemphigoid. Es ist auch denkbar, dass diese Antigendeterminante von einem anderen HLA-Typ erkannt wird, und dadurch eine andere Antikörperreaktion hervorruft. Der positive Nachweis der Antikörper bei dem PG-Serum im IFT konnte durch den Westernblot bestätigt werden.
4. Diskussion 84 Unter den 16 PV-Seren konnten in 3 anti-BP230-R2-Antikörper nachgewiesen werden, gerichtet gegen ein Fragment der Rod-Domäne. Weil anti-BP230-Antikörper im Allgemeinen keine klinische Bedeutung beim PV haben, könnte es darauf hindeuten, dass die Reaktionen gegen BP230-R2 unspezifisch bei der Analytik von Antikörpern in BP-Seren sind. Bei 2 der 3 Seren, die anhand der IFT-Ergebnisse nur Antikörper gegen N-terminale Epitope auf BP230 enthielten und bei einem dritten Serum, das ohne positiven Antikörpernachweis im IFT blieb, konnten anti-BP230-C3-Antikörper nachgewiesen werden. Eventuell banden diese Antikörper ausschließlich an lineare Epitope, die in der indirekten Immunfluoreszenz nicht zugänglich waren. Mit einem Wechsel von Expressions- und Testsystem konnte eine Steigerung der Sensitivität gemessen am BP230-C3-Polypeptid um 10% erzielt werden (von 55% auf 65%) bei vergleichbarer Spezifität (100% und 98,8%). Das Ergebnis steht im Einklang mit der Fachliteratur (z. B. Skaria et al., 2000) 4.6 ELISA mit BP230-C3 Die Entwicklung eines ELISA basierte auf dem Polypeptid BP230-C3, mit dem die höchste Sensitivität gemessen an dem Kollektiv von Seren von BP-Patienten erzielt werden konnte. Es wurde darauf verzichtet, ein Gemisch aus mehreren Proteinen einzusetzen, denn einzelne Proteine eignen sich erfahrungsgemäß besser, um ein gut reproduzierbares Testsystem zu entwickeln. Der ELISA bietet gegenüber dem Westernblot mehrere Vorteile: er kann in Voll- Automaten abgearbeitet werden, ist gut quantifizierbar und kann zur Titerkontrolle eingesetzt werden. Der prototypische Anti-BP230-C3-ELISA besaß eine Sensitivität von 63% (31/49) gemessen an den Seren aus dem BP-Kollektiv bei einer Spezifität von 97% (3/94) gemessen an Seren aus einem Kollektiv gesunder, junger Blutspender. Von den 101 Patienten mit Hautkrankheiten über 70 Jahren konnten in 12 Seren anti-BP230-Antikörper nachgewiesen werden, darunter 3, die bereits im IFT positiv waren. Diskrepante Reaktionen können auf eine Rückfaltung des Proteins im ELISA zurückzuführen sein, wodurch sich eine neue Konformation ausbildet. Ferner könnte es sich um eine Reaktion nur gegen lineare Epitope handeln oder auf die höhere Antigen-Konzentration verglichen mit dem IFT zurückzuführen sein.
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- Seite 47 und 48: 3. Ergebnisse 44 Abbildung 22: IIF-
- Seite 49 und 50: 3. Ergebnisse 46 27 der 49 Seren vo
- Seite 51 und 52: 3. Ergebnisse 48 Westernblot verwen
- Seite 53 und 54: 3. Ergebnisse 50 Abbildung 25: Für
- Seite 55 und 56: 3. Ergebnisse 52 Von den Kolonien,
- Seite 57 und 58: 3. Ergebnisse 54 3.3.4 DNA-Sequenzi
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- Seite 99 und 100: 7. Abkürzungsverzeichnis 96 7 Abk
4. Diskussion 84<br />
Unter den 16 PV-Seren konnten in 3 anti-BP230-R2-Antikörper nachgewiesen werden,<br />
gerichtet gegen ein Fragment der Rod-Domäne. Weil anti-BP230-Antikörper im Allgemeinen<br />
keine klinische Bedeutung beim PV haben, könnte es darauf hindeuten, dass die Reaktionen<br />
gegen BP230-R2 unspezifisch bei der Analytik von Antikörpern in BP-Seren sind.<br />
Bei 2 der 3 Seren, die anhand der IFT-Ergebnisse nur Antikörper gegen N-terminale Epitope<br />
auf BP230 enthielten und bei einem dritten Serum, das ohne positiven Antikörpernachweis im<br />
IFT blieb, konnten anti-BP230-C3-Antikörper nachgewiesen werden. Eventuell banden diese<br />
Antikörper ausschließlich an lineare Epitope, die in der indirekten Immunfluoreszenz nicht<br />
<strong>zu</strong>gänglich waren.<br />
Mit einem Wechsel von Expressions- und Testsystem konnte eine Steigerung der Sensitivität<br />
gemessen am BP230-C3-Polypeptid um 10% erzielt werden (von 55% auf 65%) bei<br />
vergleichbarer Spezifität (100% und 98,8%). Das Ergebnis steht im Einklang mit der<br />
Fachliteratur (z. B. Skaria et al., 2000)<br />
4.6 ELISA mit BP230-C3<br />
Die Entwicklung eines ELISA basierte auf dem Polypeptid BP230-C3, mit dem die höchste<br />
Sensitivität gemessen an dem Kollektiv von Seren von BP-Patienten erzielt werden konnte.<br />
Es wurde darauf verzichtet, ein Gemisch aus mehreren Proteinen ein<strong>zu</strong>setzen, denn einzelne<br />
Proteine eignen sich erfahrungsgemäß besser, um ein gut reproduzierbares Testsystem <strong>zu</strong><br />
entwickeln. Der ELISA bietet gegenüber dem Westernblot mehrere Vorteile: er kann in Voll-<br />
Automaten abgearbeitet werden, ist gut quantifizierbar und kann <strong>zu</strong>r Titerkontrolle eingesetzt<br />
werden.<br />
Der prototypische Anti-BP230-C3-ELISA besaß eine Sensitivität von 63% (31/49) gemessen<br />
an den Seren aus dem BP-Kollektiv bei einer Spezifität von 97% (3/94) gemessen an Seren<br />
aus einem Kollektiv gesunder, junger Blutspender. Von den 101 Patienten mit<br />
Hautkrankheiten über 70 Jahren konnten in 12 Seren anti-BP230-Antikörper nachgewiesen<br />
werden, darunter 3, die bereits im IFT positiv waren. Diskrepante Reaktionen können auf eine<br />
Rückfaltung des Proteins im ELISA <strong>zu</strong>rück<strong>zu</strong>führen sein, wodurch sich eine neue<br />
Konformation ausbildet. Ferner könnte es sich um eine Reaktion nur gegen lineare Epitope<br />
handeln oder auf die höhere Antigen-Konzentration verglichen mit dem IFT <strong>zu</strong>rück<strong>zu</strong>führen<br />
sein.
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