Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck

4. Diskussion 83
4.5 BP230-Epitopmapping
Die indirekte Immunfluoreszenz mit rekombinanten Zellen zur Bestimmung von anti-BP230-
Antikörpern in Seren von BP-Patienten stellt eine angemessene Ausweichmöglichkeit zu den
bisher verfügbaren ELISA dar (Kromminga et al., 2000, Yoshida et al., 2006).
Die Grundgesamtheit der anti-BP230-Antikörper konnte allerdings anhand des BP230-Voll-
Längen-Proteins nicht hinreichend erfasst werden. Es wurde davon abgesehen, das Polypeptid
in einem anderen System in einer höheren Konzentration einzusetzen, weil es dazu hätte
aufgereinigt werden müssen und möglicher Weise seine authentische Konformation verloren
hätte.
In der Literatur ist bisher nicht beschrieben, dass konformationelle Epitope und
Modifikationen des BP230 eine entscheidende Rolle spielen. Aus diesem Grund sollte zur
Messung aller linearen Epitope auf BP230 eine feinmaschige Kartierung der Voll-Länge
durchgeführt werden. Zwölf Plasmide, die für unterschiedliche Teilbereiche von BP230
codierten, wurden in Bakterien exprimiert und die rekombinanten Proteine aufgereinigt.
Durch diese Eingrenzung sollte die analytische Sensitivität des Tests gesteigert werden. Die
Polypeptide wurden denaturierend aufgereinigt, wodurch eine Kopplung an einen GST-Tag
nicht erforderlich war. Der stattdessen verwendete His-Tag war mit 1,1 kD gegenüber dem
GST-Tag vergleichsweise klein (24 kD) und nicht bakteriellen Ursprungs, womit
immunogene Eigenschaften des Tags weitestgehend ausgeschlossen werden konnten. Für den
immunologischen Test wurden die Polypeptide in einer SDS-PAGE separiert und im
Westernblot eingesetzt. Auf diese Weise konnte ein Reinheitsgrad von über 95% bezogen auf
das einzelne Polypeptid erreicht werden.
Für die Untersuchung der Antikörperreaktion gegen die Teilbereiche von BP230 stand das
bereits in der Studie im IFT verwendeten Kollektiv aus 49 Seren von BP-Patienten, 11 Seren
von PG-Patienten, 16 von PV-Patienten und 94 Seren von gesunden, jungen Blutspendern zur
Verfügung. Mit dem Fragment BP230-C3 konnten in 32 Seren anti-BP230-Antikörper
nachgewiesen werden. Das entspricht den bisher in der Literatur veröffentlichen Daten
(Abbildung 40). Die Antikörper in vier weiteren Seren waren gegen Epitope außerhalb dieses
Bereichs gerichtet und waren eventuell unspezifisch für das bullöse Pemphigoid. Es ist auch
denkbar, dass diese Antigendeterminante von einem anderen HLA-Typ erkannt wird, und
dadurch eine andere Antikörperreaktion hervorruft.
Der positive Nachweis der Antikörper bei dem PG-Serum im IFT konnte durch den
Westernblot bestätigt werden.