Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck
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3. Ergebnisse 54<br />
3.3.4 DNA-Sequenzierung<br />
Die kodierenden Bereiche auf den Plasmiden stimmten <strong>zu</strong> 100% mit der Referenzsequenz von<br />
BP230 überein (siehe 1.2). Nur bei pET24d-N-BP230-N1 und pET24d-N-BP230-R2 wurde<br />
eine Mutation an den Positionen 144 nt und 4074 nt identifiziert, die aber <strong>zu</strong> keinem<br />
Aminosäureaustausch führten. Die Plasmide pET24d-N-BP230-C und -C1 kodierten<br />
zwischen Position 6048 nt und 6049 nt für das Intron Nr. 23 (Genbank<strong>zu</strong>griffsnummer CCDS<br />
4959.1), wodurch das Leserasters verschoben wurde. Die kodierenden Sequenzen von pET24-<br />
d-N-BP230-C1[+23] und pET24-d-N-BP230-C[+23] (Bezeichnungsänderung) mussten<br />
korrigiert werden.<br />
3.3.5 Korrektur von pET24d-N-BP230-C[+23] und -BP230-C1[+23]<br />
Bei der Sequenzierung der kodierenden Sequenzbereiche von pET24-d-N-BP230-C1[+23]<br />
und pET24-d-N-BP230-C[+23] stellte sich heraus, dass die kommerzielle cDNA<br />
DKFZp686C04183Q ein Intron (Nr. 23) enthielt. Für die Richtigstellung der Sequenz wurde<br />
davon abgesehen von genomischer DNA eine RT-PCR durch<strong>zu</strong>führen, denn von BP230<br />
existieren mehrere Isoformen.<br />
Für das Plasmid pET24d-N-BP230-C[+23] wurde folgende Strategie für die Korrektur<br />
verfolgt: pET24d-N-BP230-C[+23] wurde über die Restriktionsschnittstellen XhoI und EcoRI<br />
(Abbildung 13) geöffnet (siehe 2.13.3), wodurch sich eine Deletion des Introns ergab. Die<br />
fehlenden Sequenzbereiche stromaufwärts und stromabwärts des Introns wurden neu<br />
synthetisiert (siehe 2.13.1), miteinander verbunden (Overlap-PCR, siehe 2.13.1.1) und in das<br />
linearisierte Plasmid integriert (siehe 2.13.5).<br />
Das Plasmid pET24d-N-BP230-C1[+23] wurde durch Gensynthese korrigiert, weil nur 63<br />
Nukleotide des Exons 24 <strong>zu</strong>r Vervollständigung des Fragments fehlten. Da<strong>zu</strong> wurden drei<br />
Oligonukleotide für das 3’-Ende synthetisiert, die sich überlappten (Abbildung 14). Das<br />
Oligonukleotid EP01224 war an seinem 5’-Ende homolog <strong>zu</strong> Exon 24 und an seinem 3’-Ende<br />
<strong>zu</strong> Exon 23. Damit in der Mehrheit das vollständige Fragment synthetisiert werden konnte,<br />
wurden die äußeren Oligonukleotide in einer 10-fach höheren Konzentration als die inneren
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