Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck
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3. Ergebnisse 53 Abbildung 27: Westernblot des Polypeptids BP230-R2 mit Ponceau-S-Färbung (links) und His-Tag-Detektion (rechts). In jeder Spur konnte das Protein mit nahezu seiner errechneten molekularen Masse identifiziert werden (54 kD). Die Proteine BP230-N2 und -N2b wurden mit der zu erwartenden molekularen Masse nachgewiesen, aber die Ausbeute an rekombinantem Zielantigen war vergleichsweise gering, was nicht auf die vermehrte Verwendung seltener tRNAs zurück geführt werden konnte. Dass BP230-C und BP230-C1 mit dem monoklonalen anti-His-Antikörper nicht nachgewiesen werden konnten, deutete darauf hin, dass die Proteine nicht funktionell exprimiert wurden. 3.3.3 Restriktionsanalyse Als Vorstufe zur DNA-Sequenzierung stellte ein Restriktionsverdau mit geeigneten Enzymen eine zusätzliche Kontrolle dar, um die zielgerichtete Integration des Fragments in den Vektor zu überprüfen. Außer von pET24d-N-BP230-C und -C1 konnten Restriktionsfragmente der erwarteten molekularen Masse nachgewiesen werden.
3. Ergebnisse 54 3.3.4 DNA-Sequenzierung Die kodierenden Bereiche auf den Plasmiden stimmten zu 100% mit der Referenzsequenz von BP230 überein (siehe 1.2). Nur bei pET24d-N-BP230-N1 und pET24d-N-BP230-R2 wurde eine Mutation an den Positionen 144 nt und 4074 nt identifiziert, die aber zu keinem Aminosäureaustausch führten. Die Plasmide pET24d-N-BP230-C und -C1 kodierten zwischen Position 6048 nt und 6049 nt für das Intron Nr. 23 (Genbankzugriffsnummer CCDS 4959.1), wodurch das Leserasters verschoben wurde. Die kodierenden Sequenzen von pET24- d-N-BP230-C1[+23] und pET24-d-N-BP230-C[+23] (Bezeichnungsänderung) mussten korrigiert werden. 3.3.5 Korrektur von pET24d-N-BP230-C[+23] und -BP230-C1[+23] Bei der Sequenzierung der kodierenden Sequenzbereiche von pET24-d-N-BP230-C1[+23] und pET24-d-N-BP230-C[+23] stellte sich heraus, dass die kommerzielle cDNA DKFZp686C04183Q ein Intron (Nr. 23) enthielt. Für die Richtigstellung der Sequenz wurde davon abgesehen von genomischer DNA eine RT-PCR durchzuführen, denn von BP230 existieren mehrere Isoformen. Für das Plasmid pET24d-N-BP230-C[+23] wurde folgende Strategie für die Korrektur verfolgt: pET24d-N-BP230-C[+23] wurde über die Restriktionsschnittstellen XhoI und EcoRI (Abbildung 13) geöffnet (siehe 2.13.3), wodurch sich eine Deletion des Introns ergab. Die fehlenden Sequenzbereiche stromaufwärts und stromabwärts des Introns wurden neu synthetisiert (siehe 2.13.1), miteinander verbunden (Overlap-PCR, siehe 2.13.1.1) und in das linearisierte Plasmid integriert (siehe 2.13.5). Das Plasmid pET24d-N-BP230-C1[+23] wurde durch Gensynthese korrigiert, weil nur 63 Nukleotide des Exons 24 zur Vervollständigung des Fragments fehlten. Dazu wurden drei Oligonukleotide für das 3’-Ende synthetisiert, die sich überlappten (Abbildung 14). Das Oligonukleotid EP01224 war an seinem 5’-Ende homolog zu Exon 24 und an seinem 3’-Ende zu Exon 23. Damit in der Mehrheit das vollständige Fragment synthetisiert werden konnte, wurden die äußeren Oligonukleotide in einer 10-fach höheren Konzentration als die inneren
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Abbildung 27: Westernblot des Polypeptids BP230-R2 mit Ponceau-S-Färbung (links) und<br />
His-Tag-Detektion (rechts). In jeder Spur konnte das Protein mit nahe<strong>zu</strong> seiner errechneten<br />
molekularen Masse identifiziert werden (54 kD).<br />
Die Proteine BP230-N2 und -N2b wurden mit der <strong>zu</strong> erwartenden molekularen Masse<br />
nachgewiesen, aber die Ausbeute an rekombinantem Zielantigen war vergleichsweise gering,<br />
was nicht auf die vermehrte Verwendung seltener tRNAs <strong>zu</strong>rück geführt werden konnte. Dass<br />
BP230-C und BP230-C1 mit dem monoklonalen anti-His-Antikörper nicht nachgewiesen<br />
werden konnten, deutete darauf hin, dass die Proteine nicht funktionell exprimiert wurden.<br />
3.3.3 Restriktionsanalyse<br />
Als Vorstufe <strong>zu</strong>r DNA-Sequenzierung stellte ein Restriktionsverdau mit geeigneten Enzymen<br />
eine <strong>zu</strong>sätzliche Kontrolle dar, um die zielgerichtete Integration des Fragments in den Vektor<br />
<strong>zu</strong> überprüfen. Außer von pET24d-N-BP230-C und -C1 konnten Restriktionsfragmente der<br />
erwarteten molekularen Masse nachgewiesen werden.
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