Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck

3. Ergebnisse 52
Von den Kolonien, die das gewünschte Insert enthielten, wurden Flüssigkulturen angelegt.
Die Analyse der funktionellen Expression wurde in der Testexpression (siehe 2.13.8)
durchgeführt.
3.3.2 Testexpression
Die Funktionalität der Expressionsplasmide wurde durch einen Nachweis der rekombinanten
Polypeptide über eine His-Tag-Detektion im Westernblot überprüft. Damit ein Protein für
die weitere Analytik eingesetzt werden konnte, musste es mit seiner apparenten molekularen
Masse nachgewiesen werden. War das nicht gegeben, musste davon ausgegangen werden,
dass das entsprechende Expressionsplasmid nicht funktionell gewesen ist. Bei der Kontrolle
(untransfizierte Zellen) durfte ein Molekül dieser Größe nicht identifiziert werden. Zusätzlich
wurden nach Ponceau-S-Färbung die Intensitäten der dem jeweiligen rekombinanten Protein
entsprechenden Bande der unterschiedlichen Klone untereinander verglichen. Der Klon mit
der stärksten Bandenintensität wurde als derjenige mit der besten Ausbeute ausgewählt.
Es konnte für die Polypeptide BP230-N, -N1, -N2a, -N2c, -R, -R1, -R2, -C2 und -C3 gezeigt
werden, dass sie in einer für die Aufreinigung ausreichenden Menge produziert wurden und
die erwartete molekulare Masse besaßen. Dieses ist beispielhaft für BP230-R2 (54 kD) in
Abbildung 27 gezeigt. Die Bande nach His-Tag-Detektion entsprach in etwa 54 kD und
damit der errechneten molekularen Masse. Die untransfizierten Zellen exprimierten kein 54
kD Protein (ohne Abbildung). Zusätzlich konnten Polypeptide anderer molekularer Massen
nachgewiesen werden, bei denen es sich wahrscheinlich um Dimere bzw. Bruchstücke dieses
Proteins handelte. Durch die Miniaturisierung des Westernblot (siehe 2.15.5) sollten diese
Nebenprodukte in den Polypeptidgemischen später keine Rolle spielen.