Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck

3. Ergebnisse 50
Abbildung 25: Für Teilbereiche von BP230 (Genbankzugriffsnummer M69225) codierende
Sequenzabschnitte (Überlappung um 20 Aminosäurenreste). a) Die kodierenden Sequenzen
von BP230: N (N-terminaler Bereich), R (Rod-Domäne) und C (C-terminaler Bereich). b) Für
die Kartierung von BP230 hergestellte Teilstücke von BP230. c) Aufgrund der geringen
Expression von BP230-N2 produzierte alternative Fragmente BP230-N2a, -N2b und -N2c.
Für die PCR-Amplifikation der BP230 cDNA-Segmente wurden die kommerziellen cDNA-
Klone DKFZp686C04183Q und IRAKp961A12140Q (siehe 2.8) oder genomische DNA der
humanen Zelllinie HEK293 (siehe 2.11) als Vorlage genutzt. Bei DKFZp686C04183Q
handelt es sich um einen 5’-EST-Klon, der vom 5’-Ende sequenziert ist und dessen Sequenz
vom 3’-Ende nicht analysiert wurde. Im Gegensatz dazu ist IRAKp961A12140Q ein cDNA-
Klon, dessen Sequenz vollständig bekannt ist. Für die Bereiche der Rod-Domäne (BP230-R
und -R’), die durch die kommerziellen cDNAs nicht abgedeckt wurden, wurde genomische
DNA der humanen Zelllinie HEK293 (siehe 2.11) verwendet. Da die kodierenden
Sequenzbereiche auf zwei Exons lokalisiert waren, wurden die Amplifikate durch Overlap-
PCR (siehe 2.13.1.1) zusammengefügt. In Abbildung 11 (siehe 2.12.2.1) ist das
Amplifikationsschema für die Expressionskonstrukte gezeigt. Für die Herstellung der cDNA-
Teilbereiche von BP230-N2 wurden die in Abbildung 12 dargestellten Oligonukleotide
verwendet.
Die synthetisierten DNA-Abschnitte wurden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen
restringiert, um in die mit NcoI und XhoI linearisierten Vektoren pET24d-N bzw. pET24d
(siehe 2.9) durch die T4-DNA-Ligase integriert zu werden (siehe 2.13.5). Die Plasmide
unterscheiden sich in der Positionierung der für den His-Tag kodierenden Sequenz. Die