Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck

3. Ergebnisse 49
3.3 Herstellung der Expressionskonstrukte (bakterielles System)
Zur Identifizierung von Bereichen auf BP230, die bevorzugt von anti-BP230-Autoantikörpern
gebunden werden, wurde ein Epitopmapping mit 5 N-terminalen, 3 C-terminalen und 2
Fragmente der Rod-Domäne durchgeführt. Zur Analyse linearer Epitope bot es sich an, die
Proteine im bakteriellen Expressionsystem herzustellen. Für eine optimale Ausbeute der
Polypeptide wurden BP230-Fragmente im Größenbereich von 20-50 kD erzeugt, da kleinere
und größere Proteine tendenziell zu einer Verringerung der Ausbeute führen. Sie überlappten
in Anlehnung an eine „PepScan“-Analyse um 20 Aminosäurereste, um keine B-Zell-Epitope
unberücksichtigt zu lassen. Die Analyse wurde im Westernblot-System durchgeführt.
Die Ergebnisse sollten die Grundlage für die Entwicklung eines ELISA bilden, der die anti-
BP230-Autoantikörper in Seren von Patienten misst.
3.3.1 DNA-Klonierungsarbeiten
Die Nukleotidsequenz der für BP230 kodierenden DNA (Genbankzugriffsnummer M69225)
wurde in drei etwa gleich große, sich um etwa 20 Aminosäuren überlappende Segmente
unterteilt (BP230-N, BP230-R und BP230-C). Ausgehend von den für diese Bereiche
kodierenden Sequenzen, wurde feiner untergliedert in BP230-N1 und -N2, BP230-R1 und
-R2, BP230-C-1, -C2 und -C3 (Abbildung 25). Da die Ausbeute für BP230-N und -N2 sehr
gering war (siehe 3.3.6), wurden drei kleinere, überlappende Teilfragmente hergestellt
(BP230-N2a, -N2b und –N2c). Dadurch sollte die Problemregion weiter eingegrenzt und die
Proteinexpression gesteigert werden.