Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck

Inhaltsverzeichnis
II
2.13.8 Testexpression.................................................................................................. 30
2.13.9 DNA-Sequenzierung ........................................................................................ 30
2.13.10 Anzucht von E. coli im präparativen Maßstab................................................. 30
2.13.11 Transfektion von Säugerzellen......................................................................... 31
2.14 Herstellung eines polyklonalen anti-BP230-Antikörpers............................................. 31
2.15 Biochemische Methoden .............................................................................................. 32
2.15.1 Proteinaufreinigung.......................................................................................... 32
2.15.1.1 Aufschluss der Bakterien und Präparation von Einschlusskörperchen........ 32
2.15.1.2 Isolation von Einschlusskörperchen aus E. coli........................................... 32
2.15.1.3 Immobilisierte Metallchelat-Affinitäts-Chromatographie (IMAC) ............. 33
2.15.1.4 Kationenaustausch-Chromatographie .......................................................... 33
2.15.1.5 Proteinkonzentrations-Bestimmung (BCA) ................................................. 34
2.15.1.6 TCA-Fällung ................................................................................................ 34
2.15.1.7 Massenspektrometrie.................................................................................... 34
2.15.2 Enzyme-linked-immunosorbent assay (ELISA) .............................................. 35
2.15.3 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)........... 35
2.15.4 Coomassie-Färbung.......................................................................................... 36
2.15.5 Proteintransfer auf eine Membran (Westernblot)............................................. 36
2.15.5.1 Miniaturisierung des Westernblot ................................................................ 36
2.15.6 Immunchemischer Nachweis ........................................................................... 37
2.15.6.1 Ponceau-S-Färbung ...................................................................................... 37
2.15.6.2 Immunmarkierung........................................................................................ 37
2.15.7 Indirekter Immunfluoreszenz Test (IFT).......................................................... 38
3 Ergebnisse......................................................................................................................... 40
3.1 Herstellung der Expressionskonstrukte (eukaryotisches System)................................ 40
3.1.1 DNA-Klonierungsarbeiten ............................................................................... 40
3.1.2 Testexpression.................................................................................................. 40
3.1.3 DNA-Sequenzierung ........................................................................................ 41
3.2 Analyse relevanter Epitope auf BP230 beim bullösen Pemphigoid............................. 41
3.3 Herstellung der Expressionskonstrukte (bakterielles System) ..................................... 49
3.3.1 DNA-Klonierungsarbeiten ............................................................................... 49
3.3.2 Testexpression.................................................................................................. 52
3.3.3 Restriktionsanalyse........................................................................................... 53
3.3.4 DNA-Sequenzierung ........................................................................................ 54