Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck
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3. Ergebnisse 40<br />
3 Ergebnisse<br />
Zur Messung der Grundgesamtheit der anti-BP230-Antikörper in einem BP-Serenkollektiv<br />
wurden das BP230-Voll-Längen-Protein und seine Proteindomänen einzeln in Säugerzellen<br />
exprimiert. Als Nachweis-System für die Antikörperbindung an diese Epitope wurde der<br />
indirekte Immunfluoreszenz Test (IFT) gewählt. Um nahe<strong>zu</strong> physiologische Bedingungen für<br />
die Polypeptidanalyse <strong>zu</strong> gewährleisten, wurde auf denaturierende Reagenzien verzichtet.<br />
Zusätzlich wurden die Reaktionen gegen die Wirtszelle, einer humanen Zelle, minimiert. Des<br />
Weiteren wurde <strong>zu</strong>r optimalen diagnostischen Anwendung eine Miniaturisierung der<br />
Reaktionsansätze durchgeführt.<br />
3.1 Herstellung der Expressionskonstrukte (eukaryotisches System)<br />
3.1.1 DNA-Klonierungsarbeiten<br />
Um das Protein BP230 hinsichtlich seiner linearen und konformationellen Epitope <strong>zu</strong><br />
analysieren, wurden 4 rekombinante Polypeptide in Säugerzellen exprimiert. Dabei handelte<br />
es sich um die BP230-Voll-Länge, die N-terminale globuläre Domäne (BP230gN), die C-<br />
terminale globuläre Domäne (BP230gC) und ein Fusionskonstrukt aus diesen beiden<br />
Domänen (BP230gNC), welches ein Zwischenfragment <strong>zu</strong>r Klonierung des BP230-Voll-<br />
Längenkonstrukts sein sollte und in der Studie nicht verwendet wurde. Die Strategien <strong>zu</strong>r<br />
Konstruktion der Expressionskonstrukte von der BP230-Voll-Länge, BP230gN, -gC und<br />
-gNC sind in Kapitel 2.13.2.2 dargestellt. Für die rekombinante Genexpression (siehe 2.13.11)<br />
wurden HEK293-Zellen verwendet (siehe 2.11).<br />
3.1.2 Testexpression<br />
Der Nachweis der Funktionalität der Polypeptide konnte in der indirekten Immunfluoreszenz<br />
(siehe 2.15.7) unter Verwendung von transfizierten HEK293-Zellen als Substrat erbracht<br />
werden, was beispielhaft für pTriEx-1-BP230gC dargestellt ist (Abbildung 19). Das Substrat<br />
wurde mit einem polyklonalen anti-BP230-Antikörper inkubiert (siehe 2.14) und mit Hilfe<br />
eines anti-rabbit-IgG-FITC Konjugats nachgewiesen.
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