Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck
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2. Material und Methoden 34<br />
2.15.1.5 Proteinkonzentrations-Bestimmung (BCA)<br />
Um die Proteinkonzentration <strong>zu</strong> bestimmen, wird ein BCA-Test durchgeführt. Dabei nutzt<br />
man die Eigenschaft, dass Proteine mit Cu 2+ -Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex<br />
eingehen und <strong>zu</strong> Cu + -Ionen reduziert werden. Die Cu + -Ionen bilden mit Bicinchonin-Säure<br />
(BCA) einen violetten Komplex, der bei 570 nm photometrisch quantifiziert wird.<br />
Zu 20 µl Probe bzw. Proteinstandard (BSA-PBS, siehe 2.2) werden 200 µl BCA-Lösung<br />
(siehe 2.2) <strong>zu</strong>gegeben. Es erfolgt eine 30-minütige Inkubation bei 37°C. Die Extinktion wird<br />
bei 570 nm bestimmt und der Proteingehalt berechnet.<br />
2.15.1.6 TCA-Fällung<br />
Zur Vorbereitung von Proben für die SDS-P<strong>AG</strong>E-Analytik werden 50 µl einer Fraktion mit<br />
200 µl 10% (w/v) TCA (siehe 2.2) vermischt, 20 Minuten auf Eis inkubiert und 15 Minuten<br />
bei 20.000 x g (4°C) zentrifugiert. Dadurch werden die enthalten Proteine ausgefällt. Das<br />
Sediment wird mit Aceton gewaschen und nach Zentrifugation in 240 µl PBS-U (siehe 2.2)<br />
solubilisiert. Die Endfraktion kann für die SDS-P<strong>AG</strong>E (siehe 2.15.3) eingesetzt werden.<br />
2.15.1.7 Massenspektrometrie<br />
Die Massenspektrometrie wurde in Zusammenarbeit mit dem Proteomzentrum in Rostock<br />
durchgeführt. Die in der vorliegenden Arbeit verwendete massensprektrometrische Methode<br />
wird als MALDI-TOF fingerprinting bezeichnet („matrix-assisted laser desorption ionizationtime-of-flight<br />
spectrometry“) und geht auf Karas und Hillenkamp (1988) <strong>zu</strong>rück. Da<strong>zu</strong><br />
werden die <strong>zu</strong> untersuchenden Proteingemische in einer SDS-P<strong>AG</strong>E elektrophoretisch<br />
aufgetrennt. Die Proteine werden nach einer geeigneten direkten Anfärbung (hier mit<br />
Coomassie Brialliant Blue G250) aus dem Gel isoliert, mit Trypsin verdaut und <strong>zu</strong>sammen<br />
mit einer Matrix auf einem Metallträger, der gleichzeitig als Elektrode dient, kristallisiert. Die<br />
Probe wird anschließend im Vakuum mit einem Laser bestrahlt, wodurch die ionischen<br />
Peptide von der Oberfläche abgelöst werden und durch das angelegte Hochspannungsfeld in<br />
Richtung des Detektors beschleunigt werden. Dabei ist die Flugzeit abhängig von Masse und<br />
Ladung. Anhand der ermittelten Flugzeiten und eines Vergleichs mit den Flugzeiten von<br />
Referenzpeptiden können <strong>zu</strong>nächst Masse/Ladungsverhältnisse (m/z) der Peptide aus der
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