Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck
Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck
Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck
Erfolgreiche ePaper selbst erstellen
Machen Sie aus Ihren PDF Publikationen ein blätterbares Flipbook mit unserer einzigartigen Google optimierten e-Paper Software.
2. Material und Methoden 32<br />
2.15 Biochemische Methoden<br />
2.15.1 Proteinaufreinigung<br />
2.15.1.1 Aufschluss der Bakterien und Präparation von Einschlusskörperchen<br />
Die Bakterien werden <strong>zu</strong>erst in 4 ml/g Feuchtgewicht TNE (siehe 2.2) aufgenommen. Durch<br />
die Zugabe von Lysozym (finale Konzentration: 0,2 mg/ml) (siehe 2.1) für 30 Minuten bei<br />
25°C wird die Zellwand zerstört. Es werden MgCl 2 (finale Konzentration: 10 mM) (siehe 2.1)<br />
und Benzonase (finale Konzentration: 25 U/µl) (siehe 2.1) <strong>zu</strong>gegeben. Die Suspension wird<br />
für 60 Minuten bei 37°C inkubiert, um Nukleinsäuren ab<strong>zu</strong>bauen. Der Zellaufschluss erfolgt<br />
durch zweimalige Passage in einem EmulsiFlex-C3 Hochdruck-Homogenisator (siehe 2.12)<br />
bei 1200 bar.<br />
Zur Trennung der in Detergenzien löslichen und nicht löslichen Bestandteile wird das<br />
Homogenisat mit Triton X-100 (finale Konzentration: 12% (v/v), siehe 2.1) versetzt, 30<br />
Minuten inkubiert und 20 Minuten bei 21.200 x g (4°C) zentrifugiert. Das Sediment wird in<br />
TNE (siehe 2.2) aufgenommen, zentrifugiert (21.200 x g, 4°C) und in A. dest. resuspendiert.<br />
2.15.1.2 Isolation von Einschlusskörperchen aus E. coli<br />
Zur Bestimmung des Extraktionsvolumens wird eine BCA-Proteinbestimmung (siehe 2.15.1.5)<br />
der Einschlusskörperchen-Suspension durchgeführt. Da<strong>zu</strong> wird ein 200 µl Aliquot der<br />
Suspension durch Zentrifugation (20.000 x g, 4°C) und Extraktion des Sediments mit<br />
TNGGI-5 und erneuter Zentrifugation <strong>zu</strong>r Sedimentation unlöslicher Bestandteile in Lösung<br />
überführt.<br />
Der Hauptteil der Suspension wird anschließend auf eine Proteinkonzentration von 2,5 mg/ml<br />
eingestellt, mit 1 Volumen (gemessen am Gesamtvolumen) Isopropanol (siehe 2.1) versetzt<br />
und bei 2800 x g für 10 Minuten (25°C) zentrifugiert. Zum Herauslösen der Lipide wird das<br />
Sediment in 1 Volumen 2:1 Chloroform/Methanol (siehe 2.1) resuspendiert und zentrifugiert.<br />
Der Überstand wird verworfen und die Chloroformreste in einem Waschschritt mit<br />
Isopropanol entfernt. Das Sediment wird zweimal bei 56°C in je 1 Volumen TNGGI-5 (siehe<br />
2.2) für 10 Minuten extrahiert, zentrifugiert und in TNGGI-5 resuspendiert. Alle Fraktionen<br />
werden auf einem SDS-Polyacrylamidgel (siehe 2.15.3) aufgetrennt und mit Coomassie-<br />
Lösung (siehe 2.15.4) gefärbt.
Change language