Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck

2. Material und Methoden 30
2.13.7 Plasmidisolation
Mit Antibiotika (siehe 2.1) versetztes LB-Medium (siehe 2.1) wird mit einer Bakterienkolonie
angeimpft und 24 Stunden bei 37°C inkubiert (1000 rpm). Die Plasmide werden nach
Herstellerangaben (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, siehe 2.3) isoliert.
2.13.8 Testexpression
Um zu kontrollieren, ob die rekombinant hergestellten Klone das gewünschte Protein
exprimieren, wird eine Protein-Testexpression mit einer 3 ml Übernachtkultur (siehe 2.13.7)
durchgeführt. Durch die Zugabe von 5 µl Induktionsmedium IPTG (0,4 M, siehe 2.1) wird die
Bindungsstelle für die bakterielle RNA-Polymerase auf dem Promotor zugänglich, und die für
das rekombinante Protein kodierende Sequenz kann abgelesen werden. Der Ansatz wird 3
Stunden bei 37°C inkubiert (1000 rpm). Die Absorption wird bei 600 nm gegen LB-Medium
gemessen und als Zelldichteäquivalent angesehen. Das einer optischen Dichte (OD) von 0,5
entsprechende Kulturvolumen wird bei 21.000 x g für 5 Minuten bei 25°C zentrifugiert. Das
Sediment wird in 66 µl TNUGXI-5 (siehe 2.2) sowie 34 µl NuPage LDS Sample Buffer
(siehe 2.2) resuspendiert und ein Westernblot (siehe 2.15.5) durchgeführt.
2.13.9 DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung der DNA wird von der Firma MWG Biotech AG in Ebersberg
durchgeführt.
2.13.10 Anzucht von E. coli im präparativen Maßstab
Ein Liter LB-Medium (siehe 2.1) wird mit einem Bakterienklon angeimpft und für 24
Stunden bei 37°C inkubiert (120 rpm). Das Zelldichteäquivalent wird photometrisch bestimmt
(siehe 2.13.8) und die Menge entsprechend einer OD von 0,75 bei 3000 rpm für 30 min
zentrifugiert. Das Sediment wird in 2 Liter LB-Medium aufgenommen und 1 Stunde bei 37°C
(4°C) inkubiert (120 rpm). Die Induktion der Proteinexpression erfolgt durch die Zugabe von
5 ml 0,4 M IPTG (siehe 2.1). Die Ansätze werden 3 Stunden inkubiert und 30 Minuten bei