Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck

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2. Material und Methoden 21 2.13 Molekularbiologische Methoden 2.13.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die PCR dient der DNA-Amplifikation (Mullis et al., 1990). Dazu werden Oligonukleotide verwendet (siehe 2.13.1.2), die den zu amplifizierenden DNA-Abschnitt der DNA-Vorlage (siehe 2.8) flankieren. Sie hybridisieren im 3’-Bereich mit dem Matrizenstrang und enthalten im 5’-Bereich Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme. Für die Herstellung von DNA-Fragmenten zur Klonierung wird der High Fidelity PCR Enzyme Mix (siehe 2.3) nach Herstellerangaben verwendet. Der PCR-Ansatz setzt sich aus folgenden Bestandteilen zusammen: 28,5 µl A. dest. 5 µl 10 x High Fidelity PCR buffer with MgCl 2 5 µl 2 mM dNTP (each) 5 µl Senseprimer [10 µM] 5 µl Antisenseprimer [10 µM] 1 µl Template DNA (100 – 200 ng/µl) 0,5 µl High-Fidelity PCR Enzyme Mix (5 U/µl) Hat die PCR analytische Funktion, wird die Taq-Polymerase (siehe 2.3) nach Angaben des Herstellers verwendet. Der PCR-Ansatz setzt sich wie folgt zusammen: 9,5 µl A. dest. 2 µl 10 x PCR buffer with (NH 4 ) 2 SO 4 1,6 µl 25 mM MgCl 2 (final 2 mM) 2 µl Senseprimer [10 µM] 2 µl Antisenseprimer [10 µM] 0,4 µl Template DNA (100 – 200 ng/µl) 0,5 µl Taq-Polymerase (1 U/µl) Die PCR erfolgt unter Einsatz von Standard-PCR-Protokollen (nach Herstellerangaben, Tabelle 4), für die die Polymerase-Reaktionszeit entsprechend der Näherung 1 kb/Minute berechnet wird. Die Oligonukleotide werden so gewählt, dass der Schmelzpunkt bei 56°C liegt.
2. Material und Methoden 22 Tabelle 4: Standard-PCR-Protokolle. High-Fidelity PCR Enzyme Mix Taq-Polymerase Segment Temperatur Anzahl der Dauer (°C) Zyklen Denaturierung 94 30 sec Primerhybridisierung 56 45 sec 10 Amplifikation 68 (Größe in kb x 60 Sec) Denaturierung 94 30 sec Primerhybridisierung 56 45 sec 20 (Größe in kb x 60 Sec)+10 Amplifikation 68 sec/Zyklus finale Elongation 68 10 min 1 Segment Temperatur Anzahl der Dauer (°C) Zyklen Denaturierung 94 30 sec Primerhybridisierung 56 45 sec 30 Amplifikation 72 1 min finale Elongation 68 10 min 1 2.13.1.1 Overlap-PCR Die Overlap-PCR (Higuchi et al., 1988) ist eine spezielle PCR-Technik, bei der eine Deletion innerhalb des Targets statt findet (Abbildung 10). Durch die Verwendung innerer Oligonukleotide (blau), die einen spezifischen und einen unspezifischen Teil haben, wird der dazwischen liegende Sequenzbereich (z. B. Intron) ausgeschlossen. Abbildung 10: Prinzip der Overlap-PCR. Die in blau dargestellten Oligonukleotide besitzen einen für die Exons spezifischen und einen unspezifischen Teil. Sie werden in der 10-fach geringeren Konzentration als die in rosa dargestellten Oligonukleotide für die Reaktion verwendet, wodurch sich eine Deletion des Introns ergibt.
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