Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG - Universität zu Lübeck

2. Material und Methoden 21
2.13 Molekularbiologische Methoden
2.13.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die PCR dient der DNA-Amplifikation (Mullis et al., 1990). Dazu werden Oligonukleotide
verwendet (siehe 2.13.1.2), die den zu amplifizierenden DNA-Abschnitt der DNA-Vorlage
(siehe 2.8) flankieren. Sie hybridisieren im 3’-Bereich mit dem Matrizenstrang und enthalten
im 5’-Bereich Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme.
Für die Herstellung von DNA-Fragmenten zur Klonierung wird der High Fidelity PCR
Enzyme Mix (siehe 2.3) nach Herstellerangaben verwendet. Der PCR-Ansatz setzt sich aus
folgenden Bestandteilen zusammen:
28,5 µl A. dest.
5 µl 10 x High Fidelity PCR buffer with MgCl 2
5 µl 2 mM dNTP (each)
5 µl Senseprimer [10 µM]
5 µl Antisenseprimer [10 µM]
1 µl Template DNA (100 – 200 ng/µl)
0,5 µl High-Fidelity PCR Enzyme Mix (5 U/µl)
Hat die PCR analytische Funktion, wird die Taq-Polymerase (siehe 2.3) nach Angaben des
Herstellers verwendet. Der PCR-Ansatz setzt sich wie folgt zusammen:
9,5 µl A. dest.
2 µl 10 x PCR buffer with (NH 4 ) 2 SO 4
1,6 µl 25 mM MgCl 2 (final 2 mM)
2 µl Senseprimer [10 µM]
2 µl Antisenseprimer [10 µM]
0,4 µl Template DNA (100 – 200 ng/µl)
0,5 µl Taq-Polymerase (1 U/µl)
Die PCR erfolgt unter Einsatz von Standard-PCR-Protokollen (nach Herstellerangaben,
Tabelle 4), für die die Polymerase-Reaktionszeit entsprechend der Näherung 1 kb/Minute
berechnet wird. Die Oligonukleotide werden so gewählt, dass der Schmelzpunkt bei 56°C
liegt.