"Kategorisierung von HPV-Tests" aus Geburtsh Frauenheilk ... - Zervita
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28 GebFra Magazin Früherkennung Kategorisierung von HPV-Tests Teresa Kindermann, Dinah Lier, Thomas Iftner Eine Infektion mit humanen Papillomviren der Hochrisikogruppe (HR‐HPV) ist die notwendige Voraussetzung für das Zervixkarzinom und seine Vorstufen [1]. Solch eine Infektion mit HR‐HPV kann mithilfe eines HPV-Tests nachgewiesen werden. Wenn ein Nachweis auf eine Infektion mit humanen Papillomviren der Hochrisikogruppe erbracht werden soll, obliegt die Auswahl des durchzuführenden HPV-Tests in der Regel dem Laborarzt. Dabei gibt es eine Vielzahl unterschiedlicher Tests, die sich im Verfahren, der Sensitivität und den Qualitätsmerkmalen unterscheiden. Deshalb sollten die Frauenärzte über die relevanten Informationen zu den unterschiedlichen Tests und ihrer Zuverlässigkeit verfügen, damit sie die Zuverlässigkeit der von den Laborärzten durchgeführten Tests zum Nachweis von HPV‐DNA beurteilen können. Sonderdruck für private Zwecke des Autors Die auf dem Markt verfügbaren Tests zum Nachweis von HPV‐DNA lassen sich bezüglich ihrer Nachweisart in 3 Kategorien unterteilen: " 1. Kategorie: HPV-Tests, die nachweisen können, ob generell eine Infektion mit HR‐HP-Viren vorliegt. → Nachweis HR‐HPV " 2. Kategorie: Zusätzlich zur HR‐HPV- Identifikation erfolgt die Bestimmung, ob es sich um eine Infektion mit HPV 16 oder 18 handelt. (Bei 70% der Zervixkarzinomerkrankungen liegt eine Infektion mit HPV 16/18 vor.) → Nachweis HR‐HPV und HPV 16/18 " 3. Kategorie: Hierzu werden in diesem Artikel HPV-Tests gezählt, die mittels Genotypisierung die einzelnen HPV-Typen bestimmen können. → Nachweis, HPV-Typidentifikation Ebenfalls gibt es sogenannte „hauseigene“ PCRs (Polymerase-Ketten-Reaktion, polymerase chain reaction), bei denen nur schwer eine valide Qualitätskontrolle erfolgen kann. Diese erhielten in internationalen Testvergleichen schlechte Bewertungen, und deshalb ist von deren Anwendung generell abzuraten. wird die Spezifität des Tests erhöht, ohne die klinische Sensitivität zu beeinflussen. Dies ist entscheidend, damit nur klinisch relevante Befunde weiter verfolgt werden und die Zahl der falsch-positiven Ergebnisse (HPV-DNA-positiv ohne Läsion) beschränkt bleibt. Die meisten HPV-Tests werden am Standardverfahren Digene Hybrid Capture 2 gemessen. Dieser Test, sowie Cervista ® HPV HR, Cervista ® HPV 16/18, cobas ® 4800 System und APTIMA ® HPV Assay, ist in den USA durch die „Food and Drug Administration“ (FDA) zugelassen. In Europa existiert kein zur FDA vergleichbares Zulassungsverfahren, sondern lediglich die Selbstdokumentation der Hersteller zur EU-Konformität (CE), welche kein Qualitätsmerkmal widerspiegelt. Weitere Kriterien, die Tests für den klinischen Gebrauch erfüllen sollten, finden sich in den „Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older“ nach Meijer et al. (2009) [1]. Demnach sollen Tests für den klinischen Einsatz zu Digene Hybrid Capture 2 ähnliche oder bessere Eigenschaften (Sensitivität, Spezifität, gute Übereinstimmung der Ergebnisse zwischen 2 Laboren und innerhalb eines Labors) aufweisen (l " Tab. 2). Problematik der In-vitro-Diagnostika aus In-Haus-Herstellung In-vitro-Diagnostika, die in einer Gesundheitseinrichtung bzw. einem Labor zur eigenen Anwendung hergestellt (Produkte aus In-Haus-Herstellung) und nicht in den Verkehr gebracht werden, sind nicht Bestandteil der europäischen In-vitro- Diagnostik-Richtlinie 98/79/EG, sondern unterliegen den Regelungen der einzelnen Staaten. Somit erhalten solche In-vitro-Diagnostika aus Eigenherstellung, die nicht an Dritte weitergegeben werden, keine CE-Kennzeichnung. Problematisch ist, dass der Hersteller die Konformität seiner Produkte mit den bestehenden Anforderungen (Medizinproduktegesetz, MPG) selbst bewerten muss. Zudem können Labore beispielsweise im Rahmen von Ringversuchen mit Panels der IN- STAND ev. (Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in medizinischen Laboratorien e.V.) ihre Tests validieren Wesentliche Kriterien zur Testbeurteilung ! Ein wesentliches Kriterium bei der Wahl eines HPV-Tests ist ein klinisch definierter Schwellenwert für Positivität (l " Tab. 1). Nachweismethoden mit einem klinisch bestimmten Schwellenwert (cut-off) liefern erst bei Überschreitung dieses Wertes ein positives Testergebnis. Dadurch Tab. 1 Definition von klinischer Sensitivität und Spezifität. klinische Sensitivität (Richtig- Positiv-Rate) klinische Spezifität (Falsch- Positiv-Rate) Trifft eine Aussage über alle positiven Ergebnisse verglichen mit der Anzahl der tatsächlich Erkrankten: Sensitivität ≡ positive Ergebnisse ÷ (tatsächlich Infizierte + falsch Positive) Gibt an, wie viele Patienten vom Test richtig als negativ erkannt wurden, gemessen an der Anzahl aller Negativergebnisse: Sensitivität ≡ negative Ergebnisse ÷ (tatsächlich Negative + falsch Negative [also Erkrankte]) Geburtsh Frauenheilk 2013; 73
- Seite 2 und 3: Aktuell diskutiert 29 und somit auc
- Seite 4: Aktuell diskutiert 31 RealTime High
28<br />
GebFra Magazin<br />
Früherkennung<br />
<strong>Kategorisierung</strong> <strong>von</strong> <strong>HPV</strong>-Tests<br />
Teresa Kindermann, Dinah Lier, Thomas Iftner<br />
Eine Infektion mit humanen Papillomviren der Hochrisikogruppe (HR‐<strong>HPV</strong>) ist die notwendige Vor<strong>aus</strong>setzung<br />
für das Zervixkarzinom und seine Vorstufen [1]. Solch eine Infektion mit HR‐<strong>HPV</strong> kann mithilfe<br />
eines <strong>HPV</strong>-Tests nachgewiesen werden.<br />
Wenn ein Nachweis auf eine Infektion mit humanen Papillomviren der Hochrisikogruppe erbracht werden<br />
soll, obliegt die Auswahl des durchzuführenden <strong>HPV</strong>-Tests in der Regel dem Laborarzt. Dabei gibt es eine<br />
Vielzahl unterschiedlicher Tests, die sich im Verfahren, der Sensitivität und den Qualitätsmerkmalen unterscheiden.<br />
Deshalb sollten die Frauenärzte über die relevanten Informationen zu den unterschiedlichen<br />
Tests und ihrer Zuverlässigkeit verfügen, damit sie die Zuverlässigkeit der <strong>von</strong> den Laborärzten durchgeführten<br />
Tests zum Nachweis <strong>von</strong> <strong>HPV</strong>‐DNA beurteilen können.<br />
Sonderdruck für private Zwecke des Autors<br />
Die auf dem Markt verfügbaren Tests zum<br />
Nachweis <strong>von</strong> <strong>HPV</strong>‐DNA lassen sich bezüglich<br />
ihrer Nachweisart in 3 Kategorien<br />
unterteilen:<br />
" 1. Kategorie: <strong>HPV</strong>-Tests, die nachweisen<br />
können, ob generell eine Infektion mit<br />
HR‐HP-Viren vorliegt. → Nachweis<br />
HR‐<strong>HPV</strong><br />
" 2. Kategorie: Zusätzlich zur HR‐<strong>HPV</strong>-<br />
Identifikation erfolgt die Bestimmung,<br />
ob es sich um eine Infektion mit <strong>HPV</strong><br />
16 oder 18 handelt. (Bei 70% der Zervixkarzinomerkrankungen<br />
liegt eine Infektion<br />
mit <strong>HPV</strong> 16/18 vor.) → Nachweis<br />
HR‐<strong>HPV</strong> und <strong>HPV</strong> 16/18<br />
" 3. Kategorie: Hierzu werden in diesem<br />
Artikel <strong>HPV</strong>-Tests gezählt, die mittels<br />
Genotypisierung die einzelnen <strong>HPV</strong>-Typen<br />
bestimmen können. → Nachweis,<br />
<strong>HPV</strong>-Typidentifikation<br />
Ebenfalls gibt es sogenannte „h<strong>aus</strong>eigene“<br />
PCRs (Polymerase-Ketten-Reaktion, polymerase<br />
chain reaction), bei denen nur<br />
schwer eine valide Qualitätskontrolle erfolgen<br />
kann. Diese erhielten in internationalen<br />
Testvergleichen schlechte Bewertungen,<br />
und deshalb ist <strong>von</strong> deren Anwendung<br />
generell abzuraten.<br />
wird die Spezifität des Tests erhöht, ohne<br />
die klinische Sensitivität zu beeinflussen.<br />
Dies ist entscheidend, damit nur klinisch<br />
relevante Befunde weiter verfolgt werden<br />
und die Zahl der falsch-positiven Ergebnisse<br />
(<strong>HPV</strong>-DNA-positiv ohne Läsion) beschränkt<br />
bleibt.<br />
Die meisten <strong>HPV</strong>-Tests werden am Standardverfahren<br />
Digene Hybrid Capture 2<br />
gemessen. Dieser Test, sowie Cervista ®<br />
<strong>HPV</strong> HR, Cervista ® <strong>HPV</strong> 16/18, cobas ®<br />
4800 System und APTIMA ® <strong>HPV</strong> Assay, ist<br />
in den USA durch die „Food and Drug Administration“<br />
(FDA) zugelassen. In Europa<br />
existiert kein zur FDA vergleichbares Zulassungsverfahren,<br />
sondern lediglich die<br />
Selbstdokumentation der Hersteller zur<br />
EU-Konformität (CE), welche kein Qualitätsmerkmal<br />
widerspiegelt.<br />
Weitere Kriterien, die Tests für den klinischen<br />
Gebrauch erfüllen sollten, finden<br />
sich in den „Guidelines for human papillomavirus<br />
DNA test requirements for primary<br />
cervical cancer screening in women<br />
30 years and older“ nach Meijer et al.<br />
(2009) [1]. Demnach sollen Tests für den<br />
klinischen Einsatz zu Digene Hybrid Capture<br />
2 ähnliche oder bessere Eigenschaften<br />
(Sensitivität, Spezifität, gute Übereinstimmung<br />
der Ergebnisse zwischen 2 Laboren<br />
und innerhalb eines Labors) aufweisen<br />
(l " Tab. 2).<br />
Problematik der In-vitro-Diagnostika<br />
<strong>aus</strong> In-H<strong>aus</strong>-Herstellung<br />
In-vitro-Diagnostika, die in einer Gesundheitseinrichtung<br />
bzw. einem Labor zur eigenen<br />
Anwendung hergestellt (Produkte<br />
<strong>aus</strong> In-H<strong>aus</strong>-Herstellung) und nicht in<br />
den Verkehr gebracht werden, sind nicht<br />
Bestandteil der europäischen In-vitro-<br />
Diagnostik-Richtlinie 98/79/EG, sondern<br />
unterliegen den Regelungen der einzelnen<br />
Staaten. Somit erhalten solche In-vitro-Diagnostika<br />
<strong>aus</strong> Eigenherstellung, die<br />
nicht an Dritte weitergegeben werden,<br />
keine CE-Kennzeichnung. Problematisch<br />
ist, dass der Hersteller die Konformität<br />
seiner Produkte mit den bestehenden Anforderungen<br />
(Medizinproduktegesetz,<br />
MPG) selbst bewerten muss. Zudem können<br />
Labore beispielsweise im Rahmen<br />
<strong>von</strong> Ringversuchen mit Panels der IN-<br />
STAND ev. (Gesellschaft zur Förderung<br />
der Qualitätssicherung in medizinischen<br />
Laboratorien e.V.) ihre Tests validieren<br />
Wesentliche Kriterien<br />
zur Testbeurteilung<br />
!<br />
Ein wesentliches Kriterium bei der Wahl<br />
eines <strong>HPV</strong>-Tests ist ein klinisch definierter<br />
Schwellenwert für Positivität (l " Tab. 1).<br />
Nachweismethoden mit einem klinisch<br />
bestimmten Schwellenwert (cut-off) liefern<br />
erst bei Überschreitung dieses Wertes<br />
ein positives Testergebnis. Dadurch<br />
Tab. 1<br />
Definition <strong>von</strong> klinischer Sensitivität und Spezifität.<br />
klinische<br />
Sensitivität<br />
(Richtig-<br />
Positiv-Rate)<br />
klinische<br />
Spezifität<br />
(Falsch-<br />
Positiv-Rate)<br />
Trifft eine Aussage über alle positiven Ergebnisse verglichen mit der Anzahl der tatsächlich<br />
Erkrankten:<br />
Sensitivität ≡<br />
positive Ergebnisse ÷ (tatsächlich Infizierte + falsch Positive)<br />
Gibt an, wie viele Patienten vom Test richtig als negativ erkannt wurden, gemessen an<br />
der Anzahl aller Negativergebnisse:<br />
Sensitivität ≡<br />
negative Ergebnisse ÷ (tatsächlich Negative + falsch Negative [also Erkrankte])<br />
<strong>Geburtsh</strong> <strong>Frauenheilk</strong> 2013; 73
Aktuell diskutiert<br />
29<br />
und somit auch die Akkreditierung nach<br />
DIN EN ISO 15189 bei 2-maliger erfolgreicher<br />
Teilnahme pro Jahr für den <strong>HPV</strong>-Test<br />
behalten. Allerdings erlaubt das Panel <strong>von</strong><br />
INSTAND nur die Überprüfung des Testnachweises<br />
auf die <strong>HPV</strong>-Typen 6, 11, 16<br />
und 18, wobei eine Qualitätskontrolle für<br />
die anderen 9 HR-Typen unberücksichtigt<br />
bleibt. Somit würden Tests, die gar nicht<br />
in der Lage sind, andere HR‐<strong>HPV</strong>-Typen<br />
als <strong>HPV</strong> 16/18 nachzuweisen, den Ringversuch<br />
bestehen, was die mangelnde Eignung<br />
dieses Panels für Ringversuche unterstreicht.<br />
Kurzgefasst: Ein guter Test…<br />
" …ist zugelassen durch die FDA.<br />
" …ist studiengestützt.<br />
" …erfüllt die Kriterien der Guidelines<br />
<strong>von</strong> Meijer et al. [1].<br />
" …ist vergleichbar in der klinischen<br />
Sensitivität und Spezifität zum<br />
Digene Hybride Capture 2 Test<br />
(Qiagen).<br />
" …ist möglichst frei <strong>von</strong> Kreuzreaktionen.<br />
" …erzielt gute Ergebnisse, wenn die<br />
Probe <strong>von</strong> guter Qualität ist und ein<br />
entsprechendes Transportmedium<br />
verwendet bzw. die Handhabungsempfehlungen<br />
der Packungsbeilage<br />
beachtet wurden (siehe unten).<br />
Für das <strong>HPV</strong>-Primärscreening<br />
geeignete Tests<br />
!<br />
Die wichtigsten Tests, die sich zum <strong>HPV</strong>-<br />
Primärscreening eignen und mit deren<br />
Verfahren auch in höherem Durchsatz<br />
<strong>HPV</strong> nachgewiesen werden kann, werden<br />
im folgenden Abschnitt beschrieben.<br />
Die Tests werden in alphabetischer Reihenfolge<br />
genannt, wobei die durch die<br />
FDA zugelassenen Tests zuerst genannt<br />
werden.<br />
APTIMA ® <strong>HPV</strong>-Assay (Gen Probe)<br />
HP-Viren können nicht nur über DNA,<br />
sondern ebenfalls über RNA-Tests nachgewiesen<br />
werden, was eine Differenzierung<br />
zwischen dem bloßen Nachweis <strong>von</strong><br />
<strong>HPV</strong>-Viren und <strong>HPV</strong>-infizierten Zellen erlaubt.<br />
Ein Beispiel dafür ist der APTIMA<br />
<strong>HPV</strong>-Assay (1. Kategorie), welcher die<br />
RNA der viralen Onkogene E6/E7 <strong>von</strong> 14<br />
Hochrisiko-<strong>HPV</strong>-Typen (HR‐<strong>HPV</strong> 16, 18,<br />
Tab. 2<br />
Test<br />
APTIMA ®<br />
<strong>HPV</strong>-Assay<br />
Cervista ®<br />
<strong>HPV</strong> HR<br />
Cervista ®<br />
<strong>HPV</strong> 16/18<br />
Merkmale der <strong>HPV</strong>-Tests.<br />
Cobas ®<br />
4800 System<br />
Digene Hybrid<br />
Capture 2<br />
PapilloCheck ®<br />
genotyping<br />
Assay<br />
RealTime High<br />
Risk <strong>HPV</strong>Assay<br />
1. Oktober<br />
2011<br />
1. März<br />
2009<br />
2. März<br />
2009<br />
2. April<br />
2011<br />
1. März<br />
2003<br />
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66<br />
und 68) nachweist. Bei der transkriptionsvermittelten<br />
Amplifikation werden eine<br />
reverse Transkriptase und eine RNA-Polymerase<br />
verwendet, wodurch es bei dem<br />
Verfahren zu einer exponentiellen Vervielfältigung<br />
der RNA-Zielsequenz (E6/<br />
E7) kommt. Bindet ein Amplikon an eine<br />
spezifisch markierte Nukleinsäuresonde,<br />
kann ein <strong>aus</strong>gesendetes Lichtsignal als relative<br />
Lichteinheit gemessen werden.<br />
Bei diesem Verfahren ist eine interne Kontrolle<br />
über das Zielerfassungs-Reagens integriert.<br />
Im Vergleich mit dem Digene Hybrid<br />
Capture 2 zeigt der APTIMA <strong>HPV</strong>-Assay<br />
eine höhere Spezifität. Zur Sensitivität<br />
gibt es etwas unterschiedliche Ergebnisse,<br />
mit entweder gleicher oder etwas niedriger<br />
Sensitivität als beim Digene Hybrid<br />
Capture 2 Test [4,5]. Der APTIMA <strong>HPV</strong>-Assay<br />
ist seit Oktober 2011 <strong>von</strong> der FDA zur<br />
<strong>HPV</strong>-Testung zugelassen.<br />
Kriterien der<br />
Guidelines<br />
erfüllt*<br />
Kategorie<br />
FDA-Zulassung<br />
studiengestützt<br />
Kreuzreaktionen<br />
ja ja können mit HR‐<strong>HPV</strong>-<br />
Typen, Bakterien, Hefen<br />
und Pilzen <strong>aus</strong>geschlossen<br />
werden<br />
ja ja mit <strong>HPV</strong> 67 und 70<br />
ja ja mit HR‐<strong>HPV</strong> 31<br />
ja ja können mit 22 anderen<br />
<strong>HPV</strong>-Typen und 83 Mikroorganismen<br />
<strong>aus</strong>geschlossen<br />
werden<br />
ja ja mit mind. 12 anderen<br />
<strong>HPV</strong>-Typen<br />
3. nein ja** ja <strong>HPV</strong> 55 mit 44 sowie<br />
<strong>HPV</strong> 13 mit 11<br />
2. nein ja ja können mit den anderen<br />
15 getesteten <strong>HPV</strong>-Typen<br />
<strong>aus</strong>geschlossen werden<br />
* Von Meijer et al., 2009 [1]<br />
** bis auf die Inter- und Intra-Reproduzierbarkeit (publizierte Daten hierfür liegen noch nicht vor)<br />
Cervista ® <strong>HPV</strong> HR und<br />
Cervista ® <strong>HPV</strong> 16/18 Test (Hologics)<br />
Cervista <strong>HPV</strong> HR (1. Kategorie) weist eine<br />
Infektion <strong>von</strong> 13 HR‐HP-Viren nach<br />
(HR‐<strong>HPV</strong> 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,<br />
56, 58, 59 und 68). Beim angewandten<br />
Signal-Amplifikationsverfahren kommt<br />
es bei Proben mit infiziertem Zellmaterial<br />
zur Bildung <strong>von</strong> unnatürlichen DNA-Triplex-Strukturen<br />
und reaktiven Botenmolekülen,<br />
deren Anzahl proportional zur<br />
Virusmenge ist und als fluoreszierende<br />
Signale gemessen werden können. Zur genaueren<br />
Bestimmung, ob eine Infektion<br />
mit <strong>HPV</strong> 16 und/oder 18 vorliegt, kann<br />
der Cervista <strong>HPV</strong> 16/18 Test durchgeführt<br />
werden (2. Kategorie). Beide Tests sind<br />
seit März 2009 durch die FDA zugelassen<br />
und studiengestützt [6–12].<br />
Cobas ® 4800 System (Roche)<br />
Das Cobas 4800 System (2. Kategorie) besteht<br />
<strong>aus</strong> 2 Komponenten: der Cobas<br />
× 480-Einheit (für die vollautomatisierte<br />
Nukleinsäure-Aufarbeitung mit PCR-Ansatz)<br />
und dem Echtzeit-PCR-Analysesystem<br />
Cobas z 480. Mittels Echtzeit-PCR<br />
kann im Gegensatz zur Endpunkt-PCR<br />
(Anzahl definierter Amplifikationsschritte<br />
und festgelegtem Endpunkt) die Zahl der<br />
Amplifikationsprodukte während der<br />
Synthese erfasst werden und dies ermöglicht<br />
somit einen quantitativen Nachweis.<br />
Mit dem Test können 14 HR‐<strong>HPV</strong>-Typen<br />
(HR‐<strong>HPV</strong> 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,<br />
56, 58, 59, 66 und 68) nachgewiesen werden,<br />
wobei die Probe gleichzeitig auf<br />
HR‐<strong>HPV</strong> und <strong>HPV</strong> 16/18 getestet wird.<br />
Der klinische Schwellenwert wurde festgelegt,<br />
um klinisch relevante zervikale intraepitheliale<br />
Läsionen zu erkennen. Das<br />
Sonderdruck für private Zwecke des Autors<br />
<strong>Geburtsh</strong> <strong>Frauenheilk</strong> 2013; 73
30<br />
GebFra Magazin<br />
Cobas 4800 System ist seit April 2011<br />
durch die FDA zugelassen und erfüllt die<br />
Kriterien der Guidelines <strong>von</strong> Meijer et al.<br />
(2009).<br />
Digene Hybrid Capture 2 (Qiagen)<br />
Beim Digene Hybrid Capture 2 (1. Kategorie)<br />
findet der Nachweis <strong>von</strong> <strong>HPV</strong> mittels<br />
eines Signal-Amplifikationsverfahrens<br />
statt. Insgesamt erkennt dieses Testverfahren,<br />
anhand der synthetischen, zur<br />
<strong>HPV</strong>-Genomsequenz komplementären<br />
RNA-Sonden, 18 Virustypen in jeweils<br />
nach Risikogruppe getrennten Reaktionen.<br />
13 der detektierten HP-Viren gehören<br />
zur Hochrisikogruppe (HR‐<strong>HPV</strong> 16,<br />
18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59<br />
und 68) und 5 entsprechen der Niedrigrisikogruppe<br />
(LR‐<strong>HPV</strong> 6, 11, 42, 43 und 44).<br />
Sonderdruck für private Zwecke des Autors<br />
Die spezifisch gebildeten und markierten<br />
DNA‐RNA-Hybride können anhand des<br />
emittierten Lichtes gemessen werden,<br />
wobei die relative Lichtintensität proportional<br />
zur vorhandenen Ziel-DNA ist und<br />
so ein semiquantitatives Maß der Virusmenge<br />
darstellt.<br />
Der klinisch definierte Schwellenwert<br />
liegt bei 4500–8000 (Anzahl Kopien je Reaktion),<br />
abhängig vom <strong>HPV</strong>‐Typ. Der empfohlene<br />
Schwellenwert der FDA liegt bei<br />
1pg <strong>HPV</strong>‐DNA pro 1 ml Probe (bei <strong>HPV</strong><br />
16 : 6000 Kopien pro Reaktion), entsprechend<br />
einem Wert relativer Lichtintensität<br />
(RLU/Coeff) <strong>von</strong> 1,0.<br />
Ein Problem dieses Tests sind die möglichen<br />
Kreuzreaktionen mit mind. 12 anderen<br />
<strong>HPV</strong>-Typen. Dies hat jedoch keinen<br />
großen nachteiligen Einfluss auf die klinische<br />
Sensitivität, aber einen gewissen<br />
Einfluss auf die Spezifität des Testverfahrens.<br />
Der Hybrid Capture 2 Assay ist der in Routineuntersuchungen<br />
am weitesten verbreitete<br />
und in größter Stückzahl eingesetzte<br />
Test, der in vielen Querschnittsstudien<br />
sowie in kontrollierten randomisierten<br />
prospektiven Studien seine her<strong>aus</strong>ragende<br />
Wertigkeit bewiesen hat. Er ist<br />
bereits seit März 2003 durch die FDA zugelassen.<br />
PapilloCheck ® genotyping Assay<br />
(Greiner Bio-One)<br />
Der PapilloCheck genotyping Assay (3. Kategorie)<br />
beruht auf Detektion eines Fragments<br />
der E1-Einheit des <strong>HPV</strong>-Genoms.<br />
Abb. 1 Darstellung der Genomorganisation eines humanen Papillomvirus (<strong>HPV</strong>) mit den Leserahmen<br />
(E1–E8, L1, L2) und der Long Control Region (LCR) (Quelle: Neumeister B et al., Hrsg. Mikrobiologische<br />
Diagnostik. 2. Aufl. Stuttgart: Thieme Verlag; 2009: S. 479 ff).<br />
Bei diesem Test können simultan 24<br />
<strong>HPV</strong>-Typen genau genotypisiert werden<br />
(<strong>HPV</strong> 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42,<br />
43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66,<br />
68, 70, 73 und 82). Die in einer PCR amplifizierten<br />
E1-Fragmente (l " Abb. 1) bilden<br />
mit spezifischen DNA-Proben Hybride.<br />
Während der Hybridisierung findet<br />
auch die Fluoreszenzmarkierung statt,<br />
dessen Signal mit dem CheckScanner<br />
(Greiner Bio-One) sichtbar gemacht und<br />
der dazugehörigen CheckReport Software<br />
<strong>aus</strong>gewertet werden kann. Die Qualität<br />
der Einzelproben, sowie Ausführung<br />
und Effizienz der Hybridisierung werden<br />
durch integrierte Kontrollelemente geprüft.<br />
Der PapilloCheck gehört zu den<br />
Tests, die durch verschiedene Studien validiert<br />
wurden [13–15]. Für den Papillo-<br />
Check wurde in der Publikation <strong>von</strong> Hesselink<br />
et al. (2010) [2] die Sensitivität und<br />
Spezifität zur bereits validierten Methode<br />
GP5+/6+-PCR-Enzym Immunoassay (welche<br />
wiederum zum Digene Hybrid Capture<br />
2 validiert wurde) bestätigt.<br />
Allgemein werden heutzutage zunehmend<br />
reverse Hybridisierungsverfahren,<br />
wie beim PapilloCheck, angewandt. Vorteilhaft<br />
ist dabei die vollständige Genotypisierung<br />
einer großen Bandbreite <strong>von</strong><br />
<strong>HPV</strong>-Typen in einer Analyse.<br />
PCR (h<strong>aus</strong>eigen)<br />
im spezialisierten Labor<br />
Eine Möglichkeit beim Verfahren der Ziel-<br />
Amplifikation ist die Replikation über<br />
eine Polymerase-Ketten-Reaktion. Durch<br />
eine PCR werden spezifische DNA-Zielsequenzen,<br />
wie <strong>HPV</strong>‐DNA, exponentiell vervielfältigt,<br />
wobei eine äußerst sorgfältige<br />
Durchführung zur Vermeidung falsch positiver<br />
Resultate durch kreuzkontaminierte<br />
Proben erforderlich ist. Daher können<br />
sie nur in spezialisierten Laboren durchgeführt<br />
werden.<br />
Um möglichst viele relevante <strong>HPV</strong>-Typen<br />
zu identifizieren, werden im PCR-Verfahren<br />
Primer verwendet, die an eine bestimmte<br />
konservierte Region am <strong>HPV</strong>-<br />
Genom binden und somit potenziell in<br />
der Lage sind, alle Virustypen in der<br />
Schleimhaut zu erkennen. Zur Verwendung<br />
kommen sowohl Gemische <strong>von</strong> verschiedenen<br />
Primern als auch Primer-Paare<br />
mit veränderlicher Basenzusammensetzung,<br />
um eine möglichst große Anzahl<br />
unterschiedlicher <strong>HPV</strong>-Typen zu detektieren<br />
[16].<br />
<strong>Geburtsh</strong> <strong>Frauenheilk</strong> 2013; 73
Aktuell diskutiert<br />
31<br />
RealTime High Risk <strong>HPV</strong> Assay<br />
(Abbott)<br />
Die Echtzeit-PCR wird als quantitativer<br />
Nachweis beim RealTime High Risk <strong>HPV</strong><br />
Assay (2. Kategorie) angewandt. Hier können<br />
14 HR‐<strong>HPV</strong>-Typen nachgewiesen<br />
(HR‐<strong>HPV</strong> 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,<br />
56, 58, 59, 66 und 68) sowie gleichzeitig<br />
<strong>HPV</strong> 16 und 18 typisiert werden. Eine interne<br />
Kontrolle wertet die Eignung der<br />
Zellen, die Qualität und Effizienz des<br />
DNA-Extraktionsprozesses und die Effizienz<br />
der Amplifikation <strong>aus</strong>. Über 4 unterschiedliche<br />
Fluorochrome können bei diesem<br />
Test Signale für HR‐<strong>HPV</strong> 16 und 18<br />
sowie für die interne Kontrolle <strong>aus</strong>gewertet<br />
werden. Der Cut-off-Wert wurde festgelegt,<br />
um klinisch relevante zervikale intraepitheliale<br />
Läsionen zu erkennen. Der<br />
RealTime High Risk <strong>HPV</strong> Assay ist studiengestützt<br />
[14,17–22] und zeigt in einer aktuellen<br />
Studie eine dem Digene Hybrid<br />
Capture 2 vergleichbare klinische Spezifität<br />
und Sensitivität [21]. Damit erfüllt er<br />
die Kriterien der Guidelines <strong>von</strong> Meijer et<br />
al. [1].<br />
Vor<strong>aus</strong>setzung für zuverlässige<br />
Testergebnisse<br />
!<br />
Eine Grundvor<strong>aus</strong>setzung für zuverlässige<br />
<strong>HPV</strong>‐DNA-Detektion und ‐Typisierung ist<br />
die gute Qualität der Probe. Dafür muss<br />
die Probenentnahme unbedingt <strong>aus</strong> der<br />
Transformationszone und der Endozervix<br />
oder <strong>von</strong> einer klinisch sichtbaren Läsion<br />
erfolgen. Die Temperatur bei der Aufbewahrung<br />
und dem Versand spielt eine<br />
Rolle für die Intakthaltung der viralen Nukleinsäuren.<br />
Je nach Auffang- und Transportmedium<br />
können diese Bedingungen<br />
variieren, deshalb ist die Einhaltung der<br />
Empfehlungen auf der Packungsbeilage<br />
des Transportmediums für den jeweiligen<br />
<strong>HPV</strong>-Test wesentlich.<br />
Transportmedium<br />
Als Transportmedium für die Erhaltung<br />
<strong>von</strong> viralen Nukleinsäuren gibt es nach<br />
heutigem Stand ein <strong>von</strong> der FDA zugelassenes<br />
Medium: das Specimen-Transport-<br />
Medium (Qiagen). Zwei weitere Medien<br />
sind <strong>von</strong> der FDA zur Zellaufbewahrung<br />
mit anschließender <strong>HPV</strong>-Testung (Hybrid<br />
Capture 2 und Cervista) empfohlen: die<br />
PreservCyt-Lösung (Hologic) sowie Surepath<br />
Preservative Fluid (TriPath imaging<br />
Inc.). Es werden auch andere Auffangund<br />
Transportmedien <strong>von</strong> kommerziellen<br />
<strong>HPV</strong>-Test-Firmen angeboten.<br />
Erfragen Sie folgende Punkte<br />
bei Ihrem Labor:<br />
" Welche/r Test/s wird/werden verwendet?<br />
– Falls mehrere Tests verwendet<br />
werden, erkundigen Sie sich,<br />
ob bzw. wie Sie bestimmen können,<br />
mit welchem Test Ihre Proben <strong>aus</strong>gewertet<br />
werden.<br />
" Erfüllt der Test die wichtigsten Kriterien?<br />
(FDA-Zulassung, Kriterien der<br />
Guidelines nach Meijer et al. [2009],<br />
studiengestützt)<br />
" Was für Kreuzreaktionen können bei<br />
dem Testverfahren vorkommen?<br />
" Wie sind die Werte der Sensitivität<br />
und Spezifität? Sind sie vergleichbar<br />
mit dem als Standardverfahren<br />
anerkannten Test Digene Hybrid<br />
Capture 2?<br />
" Welche Transportmedien werden<br />
empfohlen?<br />
Fazit<br />
!<br />
Die unterschiedlichen <strong>HPV</strong>-Tests müssen<br />
Qualitätsstandards unterliegen, wie z. B.<br />
den <strong>von</strong> Meijer et al. geforderten Kriterien<br />
in den Richtlinien [1] (Guidelines for human<br />
papillomavirus DNA test requirements<br />
for primary cervical cancer screening<br />
in women 30 years and older.). H<strong>aus</strong>eigene<br />
PCRs und schlechte DNA-Präparationen<br />
stellen ein großes Problem bei der<br />
Qualitätssicherung <strong>von</strong> <strong>HPV</strong>-Tests dar. Die<br />
derzeitigen Ringversuche <strong>von</strong> INSTAND<br />
erlauben keine <strong>aus</strong>reichende Überprüfung<br />
der Leistungsfähigkeit der in<br />
Deutschland verwendeten <strong>HPV</strong>-Tests.<br />
Frauenärzte sollten sich bei ihren Laborärzten<br />
nach der angewandten Methode<br />
erkundigen, um zu erfahren, ob entsprechend<br />
qualitätsgesicherte <strong>HPV</strong>-Tests eingesetzt<br />
werden.<br />
Interessenkonflikt<br />
!<br />
Für T. Kindermann und D. Lier bestehen<br />
keine Interessenkonflikte. T. Iftner ist Erfinder<br />
und Miterfinder zweier <strong>HPV</strong>-Tests,<br />
die dem UKT oder der Firma Greiner Bio-<br />
One GmbH gehören.<br />
Literatur bei den Autoren.<br />
Korrespondenz<br />
Prof. Dr. rer. nat. Thomas Iftner<br />
Institut für Med. Virologie,<br />
Universitätsklinikum Tübingen<br />
sekretariat.iftner@<br />
med.uni-tuebingen.de<br />
Sonderdruck für private Zwecke des Autors<br />
<strong>Geburtsh</strong> <strong>Frauenheilk</strong> 2013; 73