"Kategorisierung von HPV-Tests" aus Geburtsh Frauenheilk ... - Zervita

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GebFra Magazin
Früherkennung
Kategorisierung von HPV-Tests
Teresa Kindermann, Dinah Lier, Thomas Iftner
Eine Infektion mit humanen Papillomviren der Hochrisikogruppe (HR‐HPV) ist die notwendige Voraussetzung
für das Zervixkarzinom und seine Vorstufen [1]. Solch eine Infektion mit HR‐HPV kann mithilfe
eines HPV-Tests nachgewiesen werden.
Wenn ein Nachweis auf eine Infektion mit humanen Papillomviren der Hochrisikogruppe erbracht werden
soll, obliegt die Auswahl des durchzuführenden HPV-Tests in der Regel dem Laborarzt. Dabei gibt es eine
Vielzahl unterschiedlicher Tests, die sich im Verfahren, der Sensitivität und den Qualitätsmerkmalen unterscheiden.
Deshalb sollten die Frauenärzte über die relevanten Informationen zu den unterschiedlichen
Tests und ihrer Zuverlässigkeit verfügen, damit sie die Zuverlässigkeit der von den Laborärzten durchgeführten
Tests zum Nachweis von HPV‐DNA beurteilen können.
Sonderdruck für private Zwecke des Autors
Die auf dem Markt verfügbaren Tests zum
Nachweis von HPV‐DNA lassen sich bezüglich
ihrer Nachweisart in 3 Kategorien
unterteilen:
" 1. Kategorie: HPV-Tests, die nachweisen
können, ob generell eine Infektion mit
HR‐HP-Viren vorliegt. → Nachweis
HR‐HPV
" 2. Kategorie: Zusätzlich zur HR‐HPV-
Identifikation erfolgt die Bestimmung,
ob es sich um eine Infektion mit HPV
16 oder 18 handelt. (Bei 70% der Zervixkarzinomerkrankungen
liegt eine Infektion
mit HPV 16/18 vor.) → Nachweis
HR‐HPV und HPV 16/18
" 3. Kategorie: Hierzu werden in diesem
Artikel HPV-Tests gezählt, die mittels
Genotypisierung die einzelnen HPV-Typen
bestimmen können. → Nachweis,
HPV-Typidentifikation
Ebenfalls gibt es sogenannte „hauseigene“
PCRs (Polymerase-Ketten-Reaktion, polymerase
chain reaction), bei denen nur
schwer eine valide Qualitätskontrolle erfolgen
kann. Diese erhielten in internationalen
Testvergleichen schlechte Bewertungen,
und deshalb ist von deren Anwendung
generell abzuraten.
wird die Spezifität des Tests erhöht, ohne
die klinische Sensitivität zu beeinflussen.
Dies ist entscheidend, damit nur klinisch
relevante Befunde weiter verfolgt werden
und die Zahl der falsch-positiven Ergebnisse
(HPV-DNA-positiv ohne Läsion) beschränkt
bleibt.
Die meisten HPV-Tests werden am Standardverfahren
Digene Hybrid Capture 2
gemessen. Dieser Test, sowie Cervista ®
HPV HR, Cervista ® HPV 16/18, cobas ®
4800 System und APTIMA ® HPV Assay, ist
in den USA durch die „Food and Drug Administration“
(FDA) zugelassen. In Europa
existiert kein zur FDA vergleichbares Zulassungsverfahren,
sondern lediglich die
Selbstdokumentation der Hersteller zur
EU-Konformität (CE), welche kein Qualitätsmerkmal
widerspiegelt.
Weitere Kriterien, die Tests für den klinischen
Gebrauch erfüllen sollten, finden
sich in den „Guidelines for human papillomavirus
DNA test requirements for primary
cervical cancer screening in women
30 years and older“ nach Meijer et al.
(2009) [1]. Demnach sollen Tests für den
klinischen Einsatz zu Digene Hybrid Capture
2 ähnliche oder bessere Eigenschaften
(Sensitivität, Spezifität, gute Übereinstimmung
der Ergebnisse zwischen 2 Laboren
und innerhalb eines Labors) aufweisen
(l " Tab. 2).
Problematik der In-vitro-Diagnostika
aus In-Haus-Herstellung
In-vitro-Diagnostika, die in einer Gesundheitseinrichtung
bzw. einem Labor zur eigenen
Anwendung hergestellt (Produkte
aus In-Haus-Herstellung) und nicht in
den Verkehr gebracht werden, sind nicht
Bestandteil der europäischen In-vitro-
Diagnostik-Richtlinie 98/79/EG, sondern
unterliegen den Regelungen der einzelnen
Staaten. Somit erhalten solche In-vitro-Diagnostika
aus Eigenherstellung, die
nicht an Dritte weitergegeben werden,
keine CE-Kennzeichnung. Problematisch
ist, dass der Hersteller die Konformität
seiner Produkte mit den bestehenden Anforderungen
(Medizinproduktegesetz,
MPG) selbst bewerten muss. Zudem können
Labore beispielsweise im Rahmen
von Ringversuchen mit Panels der IN-
STAND ev. (Gesellschaft zur Förderung
der Qualitätssicherung in medizinischen
Laboratorien e.V.) ihre Tests validieren
Wesentliche Kriterien
zur Testbeurteilung
!
Ein wesentliches Kriterium bei der Wahl
eines HPV-Tests ist ein klinisch definierter
Schwellenwert für Positivität (l " Tab. 1).
Nachweismethoden mit einem klinisch
bestimmten Schwellenwert (cut-off) liefern
erst bei Überschreitung dieses Wertes
ein positives Testergebnis. Dadurch
Tab. 1
Definition von klinischer Sensitivität und Spezifität.
klinische
Sensitivität
(Richtig-
Positiv-Rate)
klinische
Spezifität
(Falsch-
Positiv-Rate)
Trifft eine Aussage über alle positiven Ergebnisse verglichen mit der Anzahl der tatsächlich
Erkrankten:
Sensitivität ≡
positive Ergebnisse ÷ (tatsächlich Infizierte + falsch Positive)
Gibt an, wie viele Patienten vom Test richtig als negativ erkannt wurden, gemessen an
der Anzahl aller Negativergebnisse:
Sensitivität ≡
negative Ergebnisse ÷ (tatsächlich Negative + falsch Negative [also Erkrankte])
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Aktuell diskutiert
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und somit auch die Akkreditierung nach
DIN EN ISO 15189 bei 2-maliger erfolgreicher
Teilnahme pro Jahr für den HPV-Test
behalten. Allerdings erlaubt das Panel von
INSTAND nur die Überprüfung des Testnachweises
auf die HPV-Typen 6, 11, 16
und 18, wobei eine Qualitätskontrolle für
die anderen 9 HR-Typen unberücksichtigt
bleibt. Somit würden Tests, die gar nicht
in der Lage sind, andere HR‐HPV-Typen
als HPV 16/18 nachzuweisen, den Ringversuch
bestehen, was die mangelnde Eignung
dieses Panels für Ringversuche unterstreicht.
Kurzgefasst: Ein guter Test…
" …ist zugelassen durch die FDA.
" …ist studiengestützt.
" …erfüllt die Kriterien der Guidelines
von Meijer et al. [1].
" …ist vergleichbar in der klinischen
Sensitivität und Spezifität zum
Digene Hybride Capture 2 Test
(Qiagen).
" …ist möglichst frei von Kreuzreaktionen.
" …erzielt gute Ergebnisse, wenn die
Probe von guter Qualität ist und ein
entsprechendes Transportmedium
verwendet bzw. die Handhabungsempfehlungen
der Packungsbeilage
beachtet wurden (siehe unten).
Für das HPV-Primärscreening
geeignete Tests
!
Die wichtigsten Tests, die sich zum HPV-
Primärscreening eignen und mit deren
Verfahren auch in höherem Durchsatz
HPV nachgewiesen werden kann, werden
im folgenden Abschnitt beschrieben.
Die Tests werden in alphabetischer Reihenfolge
genannt, wobei die durch die
FDA zugelassenen Tests zuerst genannt
werden.
APTIMA ® HPV-Assay (Gen Probe)
HP-Viren können nicht nur über DNA,
sondern ebenfalls über RNA-Tests nachgewiesen
werden, was eine Differenzierung
zwischen dem bloßen Nachweis von
HPV-Viren und HPV-infizierten Zellen erlaubt.
Ein Beispiel dafür ist der APTIMA
HPV-Assay (1. Kategorie), welcher die
RNA der viralen Onkogene E6/E7 von 14
Hochrisiko-HPV-Typen (HR‐HPV 16, 18,
Tab. 2
Test
APTIMA ®
HPV-Assay
Cervista ®
HPV HR
Cervista ®
HPV 16/18
Merkmale der HPV-Tests.
Cobas ®
4800 System
Digene Hybrid
Capture 2
PapilloCheck ®
genotyping
Assay
RealTime High
Risk HPVAssay
1. Oktober
2011
1. März
2009
2. März
2009
2. April
2011
1. März
2003
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66
und 68) nachweist. Bei der transkriptionsvermittelten
Amplifikation werden eine
reverse Transkriptase und eine RNA-Polymerase
verwendet, wodurch es bei dem
Verfahren zu einer exponentiellen Vervielfältigung
der RNA-Zielsequenz (E6/
E7) kommt. Bindet ein Amplikon an eine
spezifisch markierte Nukleinsäuresonde,
kann ein ausgesendetes Lichtsignal als relative
Lichteinheit gemessen werden.
Bei diesem Verfahren ist eine interne Kontrolle
über das Zielerfassungs-Reagens integriert.
Im Vergleich mit dem Digene Hybrid
Capture 2 zeigt der APTIMA HPV-Assay
eine höhere Spezifität. Zur Sensitivität
gibt es etwas unterschiedliche Ergebnisse,
mit entweder gleicher oder etwas niedriger
Sensitivität als beim Digene Hybrid
Capture 2 Test [4,5]. Der APTIMA HPV-Assay
ist seit Oktober 2011 von der FDA zur
HPV-Testung zugelassen.
Kriterien der
Guidelines
erfüllt*
Kategorie
FDA-Zulassung
studiengestützt
Kreuzreaktionen
ja ja können mit HR‐HPV-
Typen, Bakterien, Hefen
und Pilzen ausgeschlossen
werden
ja ja mit HPV 67 und 70
ja ja mit HR‐HPV 31
ja ja können mit 22 anderen
HPV-Typen und 83 Mikroorganismen
ausgeschlossen
werden
ja ja mit mind. 12 anderen
HPV-Typen
3. nein ja** ja HPV 55 mit 44 sowie
HPV 13 mit 11
2. nein ja ja können mit den anderen
15 getesteten HPV-Typen
ausgeschlossen werden
* Von Meijer et al., 2009 [1]
** bis auf die Inter- und Intra-Reproduzierbarkeit (publizierte Daten hierfür liegen noch nicht vor)
Cervista ® HPV HR und
Cervista ® HPV 16/18 Test (Hologics)
Cervista HPV HR (1. Kategorie) weist eine
Infektion von 13 HR‐HP-Viren nach
(HR‐HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,
56, 58, 59 und 68). Beim angewandten
Signal-Amplifikationsverfahren kommt
es bei Proben mit infiziertem Zellmaterial
zur Bildung von unnatürlichen DNA-Triplex-Strukturen
und reaktiven Botenmolekülen,
deren Anzahl proportional zur
Virusmenge ist und als fluoreszierende
Signale gemessen werden können. Zur genaueren
Bestimmung, ob eine Infektion
mit HPV 16 und/oder 18 vorliegt, kann
der Cervista HPV 16/18 Test durchgeführt
werden (2. Kategorie). Beide Tests sind
seit März 2009 durch die FDA zugelassen
und studiengestützt [6–12].
Cobas ® 4800 System (Roche)
Das Cobas 4800 System (2. Kategorie) besteht
aus 2 Komponenten: der Cobas
× 480-Einheit (für die vollautomatisierte
Nukleinsäure-Aufarbeitung mit PCR-Ansatz)
und dem Echtzeit-PCR-Analysesystem
Cobas z 480. Mittels Echtzeit-PCR
kann im Gegensatz zur Endpunkt-PCR
(Anzahl definierter Amplifikationsschritte
und festgelegtem Endpunkt) die Zahl der
Amplifikationsprodukte während der
Synthese erfasst werden und dies ermöglicht
somit einen quantitativen Nachweis.
Mit dem Test können 14 HR‐HPV-Typen
(HR‐HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,
56, 58, 59, 66 und 68) nachgewiesen werden,
wobei die Probe gleichzeitig auf
HR‐HPV und HPV 16/18 getestet wird.
Der klinische Schwellenwert wurde festgelegt,
um klinisch relevante zervikale intraepitheliale
Läsionen zu erkennen. Das
Sonderdruck für private Zwecke des Autors
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GebFra Magazin
Cobas 4800 System ist seit April 2011
durch die FDA zugelassen und erfüllt die
Kriterien der Guidelines von Meijer et al.
(2009).
Digene Hybrid Capture 2 (Qiagen)
Beim Digene Hybrid Capture 2 (1. Kategorie)
findet der Nachweis von HPV mittels
eines Signal-Amplifikationsverfahrens
statt. Insgesamt erkennt dieses Testverfahren,
anhand der synthetischen, zur
HPV-Genomsequenz komplementären
RNA-Sonden, 18 Virustypen in jeweils
nach Risikogruppe getrennten Reaktionen.
13 der detektierten HP-Viren gehören
zur Hochrisikogruppe (HR‐HPV 16,
18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59
und 68) und 5 entsprechen der Niedrigrisikogruppe
(LR‐HPV 6, 11, 42, 43 und 44).
Sonderdruck für private Zwecke des Autors
Die spezifisch gebildeten und markierten
DNA‐RNA-Hybride können anhand des
emittierten Lichtes gemessen werden,
wobei die relative Lichtintensität proportional
zur vorhandenen Ziel-DNA ist und
so ein semiquantitatives Maß der Virusmenge
darstellt.
Der klinisch definierte Schwellenwert
liegt bei 4500–8000 (Anzahl Kopien je Reaktion),
abhängig vom HPV‐Typ. Der empfohlene
Schwellenwert der FDA liegt bei
1pg HPV‐DNA pro 1 ml Probe (bei HPV
16 : 6000 Kopien pro Reaktion), entsprechend
einem Wert relativer Lichtintensität
(RLU/Coeff) von 1,0.
Ein Problem dieses Tests sind die möglichen
Kreuzreaktionen mit mind. 12 anderen
HPV-Typen. Dies hat jedoch keinen
großen nachteiligen Einfluss auf die klinische
Sensitivität, aber einen gewissen
Einfluss auf die Spezifität des Testverfahrens.
Der Hybrid Capture 2 Assay ist der in Routineuntersuchungen
am weitesten verbreitete
und in größter Stückzahl eingesetzte
Test, der in vielen Querschnittsstudien
sowie in kontrollierten randomisierten
prospektiven Studien seine herausragende
Wertigkeit bewiesen hat. Er ist
bereits seit März 2003 durch die FDA zugelassen.
PapilloCheck ® genotyping Assay
(Greiner Bio-One)
Der PapilloCheck genotyping Assay (3. Kategorie)
beruht auf Detektion eines Fragments
der E1-Einheit des HPV-Genoms.
Abb. 1 Darstellung der Genomorganisation eines humanen Papillomvirus (HPV) mit den Leserahmen
(E1–E8, L1, L2) und der Long Control Region (LCR) (Quelle: Neumeister B et al., Hrsg. Mikrobiologische
Diagnostik. 2. Aufl. Stuttgart: Thieme Verlag; 2009: S. 479 ff).
Bei diesem Test können simultan 24
HPV-Typen genau genotypisiert werden
(HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42,
43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66,
68, 70, 73 und 82). Die in einer PCR amplifizierten
E1-Fragmente (l " Abb. 1) bilden
mit spezifischen DNA-Proben Hybride.
Während der Hybridisierung findet
auch die Fluoreszenzmarkierung statt,
dessen Signal mit dem CheckScanner
(Greiner Bio-One) sichtbar gemacht und
der dazugehörigen CheckReport Software
ausgewertet werden kann. Die Qualität
der Einzelproben, sowie Ausführung
und Effizienz der Hybridisierung werden
durch integrierte Kontrollelemente geprüft.
Der PapilloCheck gehört zu den
Tests, die durch verschiedene Studien validiert
wurden [13–15]. Für den Papillo-
Check wurde in der Publikation von Hesselink
et al. (2010) [2] die Sensitivität und
Spezifität zur bereits validierten Methode
GP5+/6+-PCR-Enzym Immunoassay (welche
wiederum zum Digene Hybrid Capture
2 validiert wurde) bestätigt.
Allgemein werden heutzutage zunehmend
reverse Hybridisierungsverfahren,
wie beim PapilloCheck, angewandt. Vorteilhaft
ist dabei die vollständige Genotypisierung
einer großen Bandbreite von
HPV-Typen in einer Analyse.
PCR (hauseigen)
im spezialisierten Labor
Eine Möglichkeit beim Verfahren der Ziel-
Amplifikation ist die Replikation über
eine Polymerase-Ketten-Reaktion. Durch
eine PCR werden spezifische DNA-Zielsequenzen,
wie HPV‐DNA, exponentiell vervielfältigt,
wobei eine äußerst sorgfältige
Durchführung zur Vermeidung falsch positiver
Resultate durch kreuzkontaminierte
Proben erforderlich ist. Daher können
sie nur in spezialisierten Laboren durchgeführt
werden.
Um möglichst viele relevante HPV-Typen
zu identifizieren, werden im PCR-Verfahren
Primer verwendet, die an eine bestimmte
konservierte Region am HPV-
Genom binden und somit potenziell in
der Lage sind, alle Virustypen in der
Schleimhaut zu erkennen. Zur Verwendung
kommen sowohl Gemische von verschiedenen
Primern als auch Primer-Paare
mit veränderlicher Basenzusammensetzung,
um eine möglichst große Anzahl
unterschiedlicher HPV-Typen zu detektieren
[16].
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Aktuell diskutiert
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RealTime High Risk HPV Assay
(Abbott)
Die Echtzeit-PCR wird als quantitativer
Nachweis beim RealTime High Risk HPV
Assay (2. Kategorie) angewandt. Hier können
14 HR‐HPV-Typen nachgewiesen
(HR‐HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,
56, 58, 59, 66 und 68) sowie gleichzeitig
HPV 16 und 18 typisiert werden. Eine interne
Kontrolle wertet die Eignung der
Zellen, die Qualität und Effizienz des
DNA-Extraktionsprozesses und die Effizienz
der Amplifikation aus. Über 4 unterschiedliche
Fluorochrome können bei diesem
Test Signale für HR‐HPV 16 und 18
sowie für die interne Kontrolle ausgewertet
werden. Der Cut-off-Wert wurde festgelegt,
um klinisch relevante zervikale intraepitheliale
Läsionen zu erkennen. Der
RealTime High Risk HPV Assay ist studiengestützt
[14,17–22] und zeigt in einer aktuellen
Studie eine dem Digene Hybrid
Capture 2 vergleichbare klinische Spezifität
und Sensitivität [21]. Damit erfüllt er
die Kriterien der Guidelines von Meijer et
al. [1].
Voraussetzung für zuverlässige
Testergebnisse
!
Eine Grundvoraussetzung für zuverlässige
HPV‐DNA-Detektion und ‐Typisierung ist
die gute Qualität der Probe. Dafür muss
die Probenentnahme unbedingt aus der
Transformationszone und der Endozervix
oder von einer klinisch sichtbaren Läsion
erfolgen. Die Temperatur bei der Aufbewahrung
und dem Versand spielt eine
Rolle für die Intakthaltung der viralen Nukleinsäuren.
Je nach Auffang- und Transportmedium
können diese Bedingungen
variieren, deshalb ist die Einhaltung der
Empfehlungen auf der Packungsbeilage
des Transportmediums für den jeweiligen
HPV-Test wesentlich.
Transportmedium
Als Transportmedium für die Erhaltung
von viralen Nukleinsäuren gibt es nach
heutigem Stand ein von der FDA zugelassenes
Medium: das Specimen-Transport-
Medium (Qiagen). Zwei weitere Medien
sind von der FDA zur Zellaufbewahrung
mit anschließender HPV-Testung (Hybrid
Capture 2 und Cervista) empfohlen: die
PreservCyt-Lösung (Hologic) sowie Surepath
Preservative Fluid (TriPath imaging
Inc.). Es werden auch andere Auffangund
Transportmedien von kommerziellen
HPV-Test-Firmen angeboten.
Erfragen Sie folgende Punkte
bei Ihrem Labor:
" Welche/r Test/s wird/werden verwendet?
– Falls mehrere Tests verwendet
werden, erkundigen Sie sich,
ob bzw. wie Sie bestimmen können,
mit welchem Test Ihre Proben ausgewertet
werden.
" Erfüllt der Test die wichtigsten Kriterien?
(FDA-Zulassung, Kriterien der
Guidelines nach Meijer et al. [2009],
studiengestützt)
" Was für Kreuzreaktionen können bei
dem Testverfahren vorkommen?
" Wie sind die Werte der Sensitivität
und Spezifität? Sind sie vergleichbar
mit dem als Standardverfahren
anerkannten Test Digene Hybrid
Capture 2?
" Welche Transportmedien werden
empfohlen?
Fazit
!
Die unterschiedlichen HPV-Tests müssen
Qualitätsstandards unterliegen, wie z. B.
den von Meijer et al. geforderten Kriterien
in den Richtlinien [1] (Guidelines for human
papillomavirus DNA test requirements
for primary cervical cancer screening
in women 30 years and older.). Hauseigene
PCRs und schlechte DNA-Präparationen
stellen ein großes Problem bei der
Qualitätssicherung von HPV-Tests dar. Die
derzeitigen Ringversuche von INSTAND
erlauben keine ausreichende Überprüfung
der Leistungsfähigkeit der in
Deutschland verwendeten HPV-Tests.
Frauenärzte sollten sich bei ihren Laborärzten
nach der angewandten Methode
erkundigen, um zu erfahren, ob entsprechend
qualitätsgesicherte HPV-Tests eingesetzt
werden.
Interessenkonflikt
!
Für T. Kindermann und D. Lier bestehen
keine Interessenkonflikte. T. Iftner ist Erfinder
und Miterfinder zweier HPV-Tests,
die dem UKT oder der Firma Greiner Bio-
One GmbH gehören.
Literatur bei den Autoren.
Korrespondenz
Prof. Dr. rer. nat. Thomas Iftner
Institut für Med. Virologie,
Universitätsklinikum Tübingen
sekretariat.iftner@
med.uni-tuebingen.de
Sonderdruck für private Zwecke des Autors
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