Arbeitsprotokoll Lambda - DAGZ - Boku
Arbeitsprotokoll Lambda - DAGZ - Boku Arbeitsprotokoll Lambda - DAGZ - Boku
DAGZ-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 1 Übungsanleitung: Bakteriophage Lambda Das Beispiel besteht aus zwei Teilen. A) Im Teil A soll der Ausgang der Infektion von E. coli Stämmen mit unterschiedlichen Phagenvektoren beobachtet werden. Die Ergebnisse sollen im Licht der Genotypen der Wirte und Phagen diskutiert werden. B) In Teil B soll die in vivo Plasmid-Exzision durchgeführt werden (Cre-lox vermittelte Exzision aus λTriplEx) Zu Beginn werden Platten mit folgenden E. coli Wirtsstämmen ausgegeben: (Bezüglich genetischer Nomenklatur für E. coli: siehe Beilage der Kolloquiumsunterlagen) A: Interaktion von Phagen mit E. coli Wirtsstämmen C600: (hfl + ) lacY1 leuB6 supE44 thi-1 thr-1 tonA21 (mcrB + ) F - C600hfl: hflA::Tn10 lacY1 leuB6 supE44 thi-1 thr-1 tonA21 mcrB - F - (Anmerkung Transposon Tn10 (Tetracyclin-Resistenz) zerstört durch Insertion das hflA Gen) XL1-Blue: recA1 endA1 gyrA96 hsdR17 (rk - mk + ) lac - relA1 supE44 thi-1 [F´ proAB lacI q ZΔM15 Tn10] (auf dem modifizierten F-Episom, das auch Tetrazyklin-Resistenz vermittelt, befindet sich das Gen welches für das zur alpha-Komplementation (Slang: „Blau-Weiß Selektion“) notwendige lacZ Fragment kodiert) Y1090r - : araD139 hsdR (rk - mk + ) mcrA - (mcrB + ) rpsL supF trpC22::Tn10 ΔlacU169 Δlon (pMC9- lacI q ) Das Plasmid pMC9 vermittelt Amp R und führt zu Überexpression des lac-Repressors (ohne IPTG Induktion keine Expression der Phagen-Fusionsproteine). Das Tn10 Transposon vermittelt Tet R . Δlon – Defekt in einer Protease erhöht Stabilität der Fusionsproteine. B: In vivo Exzision BM25.8: für die Cre-lox vermittelte in vivo Exzision supE44 thi Δ(lac-proAB) hsdR (rk - mk - ) [F´ traD36 proAB + lacI q ZΔM15] λimm434 (Kan R ) P1 (cam R ) Der Stamm enhält einen lysogenen Lambda (selektierbar mit Kanamycin-Resistenz, vermittelt Resistenz gegen Lambda-Lyse) und einen lysogenen P1 Phagen (markiert mit Chloramphenicol- Resistenz, exprimiert das Cre-Gen). (Für die Beschriftung von Verdünnungen etc. werden folgende Abkürzungen vorgeschlagen: C: C600; H: C600hfl; X: XL1-Blue; Y: Y1090r - ; B: BM25.8)
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<strong>DAGZ</strong>-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 1<br />
Übungsanleitung: Bakteriophage <strong>Lambda</strong><br />
Das Beispiel besteht aus zwei Teilen.<br />
A) Im Teil A soll der Ausgang der Infektion von E. coli Stämmen mit<br />
unterschiedlichen Phagenvektoren beobachtet werden. Die Ergebnisse sollen im<br />
Licht der Genotypen der Wirte und Phagen diskutiert werden.<br />
B) In Teil B soll die in vivo Plasmid-Exzision durchgeführt werden (Cre-lox<br />
vermittelte Exzision aus λTriplEx)<br />
Zu Beginn werden Platten mit folgenden E. coli Wirtsstämmen ausgegeben:<br />
(Bezüglich genetischer Nomenklatur für E. coli: siehe Beilage der Kolloquiumsunterlagen)<br />
A: Interaktion von Phagen mit E. coli Wirtsstämmen<br />
C600:<br />
(hfl + ) lacY1 leuB6 supE44 thi-1 thr-1 tonA21 (mcrB + ) F -<br />
C600hfl:<br />
hflA::Tn10 lacY1 leuB6 supE44 thi-1 thr-1 tonA21 mcrB - F -<br />
(Anmerkung Transposon Tn10 (Tetracyclin-Resistenz) zerstört durch Insertion das hflA Gen)<br />
XL1-Blue:<br />
recA1 endA1 gyrA96 hsdR17 (rk - mk + ) lac - relA1 supE44 thi-1<br />
[F´ proAB lacI q ZΔM15 Tn10]<br />
(auf dem modifizierten F-Episom, das auch Tetrazyklin-Resistenz vermittelt, befindet sich das Gen<br />
welches für das zur alpha-Komplementation (Slang: „Blau-Weiß Selektion“) notwendige lacZ Fragment<br />
kodiert)<br />
Y1090r - :<br />
araD139 hsdR (rk - mk + ) mcrA - (mcrB + ) rpsL supF trpC22::Tn10 ΔlacU169 Δlon<br />
(pMC9- lacI q )<br />
Das Plasmid pMC9 vermittelt Amp R und führt zu Überexpression des lac-Repressors (ohne IPTG<br />
Induktion keine Expression der Phagen-Fusionsproteine). Das Tn10 Transposon vermittelt Tet R .<br />
Δlon – Defekt in einer Protease erhöht Stabilität der Fusionsproteine.<br />
B: In vivo Exzision<br />
BM25.8: für die Cre-lox vermittelte in vivo Exzision<br />
supE44 thi Δ(lac-proAB) hsdR (rk - mk - ) [F´ traD36 proAB + lacI q ZΔM15]<br />
λimm434 (Kan R ) P1 (cam R )<br />
Der Stamm enhält einen lysogenen <strong>Lambda</strong> (selektierbar mit Kanamycin-Resistenz, vermittelt<br />
Resistenz gegen <strong>Lambda</strong>-Lyse) und einen lysogenen P1 Phagen (markiert mit Chloramphenicol-<br />
Resistenz, exprimiert das Cre-Gen).<br />
(Für die Beschriftung von Verdünnungen etc. werden folgende Abkürzungen<br />
vorgeschlagen: C: C600; H: C600hfl; X: XL1-Blue; Y: Y1090r - ; B: BM25.8)
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Weiters werden folgende Phagensuspensionen mit (vom Tutor angegebenen) Titer<br />
ausgegeben (kann sich ändern!). Es sind dies (vorgeschlagene Kurzbezeichnung):<br />
Teil A:<br />
Phage Titer pfu/ml (Bez.) Anmerkung<br />
λgt10 O leerer Phagenvektor<br />
λgt10-L L λgt10 mit Tomate RPL3 cDNA<br />
λgt11-A A Anonyme Reis-cDNA in λgt11 Vektor<br />
EMBL3-L E genomischer Klon von Tomate RPL3 in EMBL3<br />
Teil B: Cre-loxP vermittelte Plasmid-Exzision<br />
Phage Titer pfu/ml (Bez.) Anmerkung<br />
λTriplEx T leerer Phagenvektor λTriplEx<br />
Genotypen der Phagen: siehe Beilage Kolloquiums-Unterlagen (Current Protocols)
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Aufgabenstellung:<br />
Teil A:<br />
Ausgehend von den angegebenen Titern sind solche Verdünnungen der<br />
Phagensuspensionen anzufertigen, daß auf Platten nach Infektion 10 2 bzw. 10 3<br />
Plaques zu erwarten wären (im permissiven Wirt).<br />
Anmerkungen: Phagen in SM verdünnen (nie in Wasser!). Bitte berücksichtigen Sie daß im<br />
Infektionsansatz nur 100 µl Phagensuspension zum Einsatz kommen (siehe Arbeitsvorschrift<br />
Phagentiter).<br />
Die folgenden Wirte sind mit folgenden Phagen zu infizieren (siehe Tabelle):<br />
Phagen<br />
Bakterienstämme<br />
C600<br />
(C)<br />
C600 hflA<br />
(H)<br />
XL1-Blue<br />
(X)<br />
Y1090r-<br />
(Y)<br />
λgt10<br />
(O)<br />
CO2:<br />
CO3:<br />
HO2:<br />
HO3:<br />
XO2<br />
(Teil B)<br />
λgt10-L<br />
(L)<br />
CL2:<br />
CL3:<br />
HL2:<br />
HL3:<br />
λgt11-A<br />
(A)<br />
CA2:<br />
CA3:<br />
XA2:<br />
XA3:<br />
YA2:<br />
YA3:<br />
EMBL3 L<br />
(E)<br />
CE2:<br />
CE3:<br />
HE2:<br />
HE3:<br />
XE2:<br />
XE3:<br />
YE2:<br />
YE3:<br />
λTriplEx<br />
(T)<br />
T50<br />
T250<br />
(Teil B)<br />
CO2: Vorgeschlagener Code für: C600 infiziert mit λgt10, erwartet10 2 Plaques.<br />
Negativk.<br />
(N).<br />
Bitte weiters für jeden E. coli Stamm eine Leer-Kontrolle (Ansatz ohne Phagen! nur<br />
SM) mitführen (N...Negativkontrolle).<br />
Protokoll: Diskussion der Ergebnisse (Warum funktionieren welche Phagen nicht<br />
oder schlecht mit bestimmten Wirtsstämmen. Bitte bereits für Kolloquium überlegen<br />
welches Ergebnis erwartet wird!).<br />
Teil B: Plasmid-Exzision<br />
Für dieses Experiment wird der Wirt XL1-Blue zusätzlich auch mit dem Phagen<br />
λTriplEx infiziert. Es sollen 2 Platten hergestellt werden (eine mit etwa 50, und eine<br />
mit etwa 250 Plaques). Für den leeren λTriplEx bitte zum Topagar IPTG und X-GAL<br />
hinzufügen!.<br />
Die leeren TriplEx Phagen enthalten ein intaktes lacZ‘ Gen (α-Komplementation in XL1-Blue) und<br />
bilden in Topagar mit IPTG und X-GAL blaue Plaques, was das Ausstechen für Anfänger erleichtert.<br />
Die λTriplEx Phagen werden gemeinsam mit den Phagen des Teil A am Dienstag<br />
ausplattiert. Am Mittwoch erfolgt die Elution der Phagen aus einem ausgestochen<br />
Plaque (sehr kurz) und die Infektion des Cre-exprimierenden Stammes BM25.8.<br />
CN<br />
HN<br />
XN<br />
YN
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Vorschlag: Zeitplan für die Durchführung des Beispiels<br />
Teil A Teil B<br />
Montag 12:30 Arbeitsplatz übernehmen (möglichst früh beginnen!)<br />
Medien herstellen und autoklavieren<br />
(dauert! während dessen Pipetierschema für Dienstag erstellen):<br />
Topagar, <strong>Lambda</strong> Broth und SM, Platten gießen<br />
Dienstag E. coli Stämme vorbereiten<br />
Mittwoch<br />
E. coli Kulturen animpfen, o/n 37° C<br />
Phagenverdünnungen herstellen<br />
Topagar vorbereiten,<br />
Infektionen<br />
Auszählen der Plaques<br />
(Diskussion, Protokoll)<br />
Donnerstag Platz aufräumen, Geschirr ...<br />
Arbeitsvorschrift:<br />
Rückgabe des Arbeitsplatzes<br />
⇒ XL1-Blue aus Teil A als Wirt<br />
Phagenverdünnungen<br />
Gemisch herstellen, Infektion<br />
(Achtung: Topagar + IPTG + X-Gal)<br />
o/n Kultur von BM25.8 (30°C )<br />
Austechen und Elution der<br />
Plaques<br />
Vorbereiten von BM25.8<br />
Infektion von BM25.8<br />
mit λTriplEx,<br />
Titer der eluierten Phagen<br />
Ausplattieren des Exzisionsansatzes<br />
auf LB+Amp<br />
Ampicillin-resistente BM25.8<br />
Kolonien auf Platten zählen<br />
1) Montag: Zubereitung der Medien für die Phageninfektion<br />
Bottom Agar:<br />
23 g/l NZCYM Broth<br />
15 g/l Agar (pH 7.5)
<strong>DAGZ</strong>-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 5<br />
Benötigt werden für das Beispiel etwa 40 Stück 9 cm Petrischalen mit (15 bis maximal 20 ml Agar pro<br />
Platte). Vorschlag: 750 ml autoklavieren in 1l Schottflasche, – mit Rührkern!<br />
Nicht zu dick ausgießen, Top-Agar kommt noch obenauf!)<br />
Zusammensetzung von NZCYM: z.B. (Fluka 74713 od. Roth X974.1)<br />
10 g/l N-Z Amine<br />
5 g/l NaCl<br />
5 g/l Yeast Extract<br />
1 g/l Casamino Acids<br />
2 g/l MgSO4.7 H2O (= 8 mM)<br />
Platten am Arbeitsplatz gießen und über Nacht stehen lassen.<br />
Der Agar sollte nicht zu heiß gegoßen werden (Kondenswasser am Deckel). Die Oberfäche der<br />
Platten sollte bei der Verwendung nicht feucht sein, da sich sonst der Topagar ablösen kann.<br />
Bunsenbrenner (wenn überhaupt nötig) mit Maß einsetzen – bitte die Ausgießringe der Schottflaschen<br />
nicht abfackeln!<br />
Top Agar:<br />
23 g/l NZCYM Broth pH 7.5<br />
6 g/l Agarose)<br />
(Einwaage ohne magnetischen Rührkern, kann Ergebnis verfälschen.)<br />
Benötigt werden 3 ml/Platte (150 ml in 250 ml Schottflasche – mit Rührkern<br />
autoklavieren!). Auskühlen lassen und bei Bedarf im Mikrowellenherd wieder<br />
aufschmelzen.<br />
Achtung: Für α-Komplementation IPTG und X-Gal zugeben!<br />
<strong>Lambda</strong> Medium:<br />
Zur Anzucht von E. coli für die Infektion mit Phage <strong>Lambda</strong> (max. 300 ml herstellen).<br />
23 g/l NZCYM Broth pH 7.5<br />
0.2 % Maltose (1:100 Verdünnung von 20% Stammlösung,<br />
nicht mit Stickstoffquelle autoklavieren sondern danach steril<br />
zugeben!). Die Maltose-Stammlösung wird bereitgestellt (Tutor).<br />
Suspensions Medium für <strong>Lambda</strong>: SM<br />
Phagen nie in Wasser oder EDTA hältigen Puffern verdünnen!!! Suspensionen in SM<br />
(optional mit 0.01% Gelatine) und einem Tropfen Chloroform sind auf 4°C ein Jahr<br />
ohne größere Verminderung des Titers haltbar. (Darüber hinaus ist die Lagerung bei<br />
-70°C mit 10% Glycerin oder 7% DMSO vorzuziehen).<br />
SM:<br />
50 mM Tris.Cl pH 7.5<br />
100 mM NaCl<br />
8 mM MgSO4
<strong>DAGZ</strong>-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 6<br />
Vorschlag: Für die Vorbereitung der Bakterienkulturen zur Infektion, aus<br />
bereitgestellten Stammlösungen 150 ml SM - Medium herstellen.<br />
Stammlösungen: 500 mM Tris.Cl pH 7.5 und<br />
1 M NaCl<br />
10 mM MgSO4<br />
Vorschlag: 250 ml Lösung herstellen (bzw. 1,5l für alle 6 Kandidaten gemeinsam)<br />
und autoklavieren. Zusätzlich 6 leere 250ml Schottflaschen mitautoklavieren um<br />
später darin die drei Komponenten mischen zu können.<br />
Anmerkung zur Koordination der Übungsteilnehmer:<br />
Das Autoklaviergut ist eindeutig zu beschriften (Klebeband, wasserfester Filzstift)<br />
Den Autoklaven bitte erst starten wenn alle Teilnehmer, die das Phagenbeispiel<br />
absolvieren, mit Ihren Medien fertig sind!<br />
Jedoch soll möglichst früh gestartet werden, da sonst die Platten erst gegen<br />
Praktikumsende (17.30 Uhr) gegossen werden können.<br />
Vorsicht mit heißem Agar – Siedeverzug möglich!<br />
Im Protokol sind alle Einwaagen/Pipettierschritte anzugeben.<br />
Es wird dringend angeraten während der Wartezeit (Autoklav) das<br />
Pipetierschema für die Phagenverdünnungen zu berechnen, die Eppis zu<br />
Beschriften und mit SM zu befüllen. Bitte Phagen NICHT über Nacht als<br />
Verdünnung lagern, da dies zu starken Schwankungen führt!<br />
Inokulation der Übernachtkulturen<br />
Pro Bakterienstamm etwa 20 ml <strong>Lambda</strong> Medium in sterile 100 ml Kölbchen gießen<br />
und mit Einzelkolonie beimpfen (Mit sterilem Zahnstocher, diesen nicht einwerfen,<br />
Medium darf nicht mehr heiß sein!). Inkubation bei 37°C, 200 rpm (Brutraum 05/04)<br />
(Stamm BM25.8 kommt erst später zum Einsatz, diesen noch nicht anzüchten!)
<strong>DAGZ</strong>-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 7<br />
2) Dienstag: Durchführung der Phageninfektion:<br />
Vorbereitung der Wirtsstämme:<br />
Zu den Übernachtkulturen neues <strong>Lambda</strong> Medium zugeben (auf etwa 50 ml<br />
ergänzen und nochmals 1 Stunde inkubieren, währenddessen Verdünnungen<br />
herstellen).<br />
Danach 20 ml Kultur in 50 ml Greiner Zentrifugenröhrchen ohne Stehrand überführen<br />
(und auf der Waage tarieren!). Die Zellpellets werden abzentrifugiert (10 Minuten bei<br />
500 g. Zentrifuge unbedingt sauber hinterlassen.)<br />
Die Pellets werden in 20 ml sterilem 10 mM MgSO4 resuspendiert (Vortex,<br />
Aufbewahrung bei 4°C). (Überstände sammeln - im Ko lben autoklavieren).<br />
Anmerkung: <strong>Lambda</strong> adsorbiert auch an tote E. colis, die in stationären Kulturen in relevanter Menge<br />
vorhanden sein können. Frische Zellen die noch nicht die stationäre Phase erreicht haben wären<br />
vorzuziehen. Häufig werden die Zellen in definierter Konzentration z.B. 1.5 x 10 9 Zellen/ml (etwa<br />
OD600=2) in 10 mM MgSO4 resuspendiert und bei 4°C gelagert. Solche Zellen können bis zu 3<br />
Wochen verwendet werden.<br />
Vorbereitung der Phagenverdünnungen<br />
Ausgehend von den angegebenen Titern der jeweiligen Phagen (pfu/ml) sind<br />
geeignete Verdünnungsschritte vorzunehmen, sodaß die erwünschten Zahlen von<br />
Plaques/Platte resultieren (siehe Aufgabenstellung). Verdünnungen in sterilen 1.5 ml<br />
Eppendorfgefäßen durchfühen (keine größeren Verdünnungsschritte als 1:10: 100 µl<br />
Phagensuspension + 900 ml SM).<br />
Das Pipettierschema ist im Protokoll genau anzugeben!<br />
Achtung: Bitte berücksichtigen Sie, daß im Infektionsansatz nur 100 µl Phagen-<br />
Verdünnung zum Einsatz kommen ...)<br />
Vorbereitung des Top-Agars:<br />
Platten mit Bottom-Agar rechtzeitig auf 37°C bringe n (besonders wichtig falls diese<br />
auf 4°C gelagert wurden!).<br />
Den Top-Agar aufschmelzen (Mikrowellenherd – Vorsicht: nicht überkochen lassen!),<br />
heiß 3 ml Portionen in sterile 15 ml Greiner Röhrchen abfüllen und diese in einem<br />
Wasserbad bei 48°C vorwärmen.<br />
Beim Abfüllen des Top-Agar in Röhrchen darauf achten, daß Agar nicht an der Wand erstarrt und<br />
unlösliche Klümpchen bildet (Röhrchen vorwärmen). Wasserspiegel im Wasserbad muß höher sein<br />
als der obere Rand des Topagars! Es wird empfohlen einige Röhrchen mehr als benötigt zu<br />
inkubieren!<br />
ACHTUNG: restlicher Top-Agar wird noch im Teil B benötigt (am Mittwoch in Schottflasche neu<br />
aufschmelzen, keinesfalls verschraubte Plastikröhrchen in den Mikrowellenherd geben!!!!).
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Portioniert wird mit einer 5 ml Hubpipette mit Einwegspitzen. Bitte darauf zu achten, daß der Hub der<br />
Pipette nicht von hochspritzendem Agar verlegt wird. Spitzen sparsam verwenden. Negativkontrollen<br />
(Ansätze ohne Phagen) zuletzt pipettieren.<br />
Für die 2 Platten des Teil B („Blau-Weiß Selektion“) werden in den<br />
aufgeschmolzenen Topagar kurz vor dem Ausgießen (in die Röhrchen) je 75 µl IPTG<br />
und X-Gal Stammlösungen (Tutor) pro 3 ml Topagar zugeben).<br />
IPTG: 100 mM in H2O<br />
X-Gal: 100 mM in DMSO<br />
Rechtzeitige Beschriftung der Petrischalen (Bottom Agar) nicht vergessen!<br />
(Beschriftung bitte nicht am Deckel...)<br />
Durchführung der Phageninfektion<br />
• in einem Eppendorf-Gefäß werden vereinigt und kurz gevortext:<br />
100 µl Bakteriensuspension + 100 µl Phagensuspension<br />
• 15 bis 30 Minuten bei 37°C ohne Schütteln inkubieren (Heizblock oder 37° Raum).<br />
• danach die Suspension zum vorgewärmten Topagar pipettieren,<br />
• gut durchmischen (zuschrauben, gefühlvoll vortexen oder mehrmals invertieren)<br />
und möglichst blasenfrei auf Bottom-Agar ausgießen.<br />
• Platten etwa 5 Minuten bei RT stehen lassen. Nach dem Erstarren des Topagar’s<br />
die Platten („upside down“) in Plasiksäcken bei 37°C inkubieren (12-16 Stunden).<br />
Achtung: der Arbeitsablauf ist zwar einfach - erfordert jedoch etwas Koordination.<br />
Die Inkubationszeit soll nicht wesentlich überschritten werden, sonst mischt auch die<br />
Phagen-Nachkommenschaft des ersten Wurfes im Geschehen mit und kann das<br />
Ergebnis massiv verändern. Wenn für das Ausgießen etwa 20 Sekunden<br />
veranschlagt werden und etwa 30 Proben zu verarbeiten sind, sollte es möglich sein<br />
innerhalb der Toleranz zu bleiben.<br />
Um einen Stau am Wasserbad zu vermeiden ist es unbedingt erforderlich, daß<br />
sich die Teilnehmer, die an diesem Beispiel arbeiten, absprechen und die<br />
Infektionen etwa 30 Minuten versetzt starten.<br />
Checkliste: Sind die Platten schon beschriftet?<br />
Ist ein genügend großer Abfallbehälter (Autoklaviersack) neben dem Wasserbad<br />
vorhanden? Es wird empfohlen (eventuell mit dem Tutor) eine Testrunde Topagar<br />
leer auszugießen um eine brauchbare Geschwindigkeit des Vortex zu ermitteln<br />
(möglichst keine Luftblasen!).<br />
Übernachtkultur des E. coli Stammes BM25.8 ansetzen (etwa 15 ml <strong>Lambda</strong>-Medium<br />
inokulieren), bei 30°C (rechts im „Hefebrutraum“, Tutor fragen) mit 150 rpm schütteln.
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3) Mittwoch:<br />
Die Platten der Phageninfektion sollen möglichst früh von 37°C in den Kühlraum<br />
transferiert werden (kann von einem Teilnehmer bzw. notfalls auch von TA Barbara<br />
Svoboda (Hanna Weindorfer) übernommen werden.<br />
Teil B:<br />
Bitte mit Teil B beginnen und zwischendurch die Platten des Teil A auszählen<br />
Übersicht: Im Teil B werden aus 2 ausgestochenen Plaques die Phagen eluiert und die<br />
Phagensuspensionen für die Konversion eingesezt. Um bestimmen zu können, wie effizient die<br />
Prozedur ist, wird einerseits der Titer dieser eluierten Phagen bestimmt und andererseits die Infektion<br />
des Cre-Exprimierenden Stammes durchgeführt.<br />
Elution<br />
• Auf den Platten mit den TriplEx Phagen sollten blaue Plaques sichtbar sein. Ein<br />
isoliert liegender blauer (B) Plaque, und ein Plaque von einer XO Platte (λgt10 of<br />
Rasen von XL1-Blue, K...Kontrolle) werden mit sterilen Glaspasteurpipetten (mit<br />
Sauger) ausgestochen und in 400 µl SM ausgestoßen. Zur Elution und<br />
Resuspension der Phagen zuerst 2 Minuten stark vortexen und anschließend auf<br />
37°C 1 Stunde unter Schütteln inkubieren (37°C Raum , Eppis auf Glasröhrchen<br />
stecken).<br />
Inzwischen kann Beispiel A ausgewertet werden.<br />
• Die Phagensuspensionen kurz abzentrifugieren und Überstände in neue<br />
Eppendorf Tubes überführen.<br />
Infektion von BM25.8:<br />
• Jeweils 200 µl zurückverdünnte Übernachtkultur mit 150 µl der Phagen-Eluate in<br />
einem sterilen 12 ml Greiner Röhrchen vereinigen (B, K, unverdünnt, Restliche<br />
Phagensuspension noch nicht wegwerfen!) - und ohne schütteln 30 Minuten auf<br />
30°C stehen lassen.<br />
• Danach 400 µl <strong>Lambda</strong>-Medium zugeben und 1 Stunde unter heftigem Schütteln<br />
weiterinkubieren (30°C, 200 rpm).<br />
Während dieser Wartezeit wird der Titer der eluierten Phagen<br />
bestimmt. Dazu werden von den Phagensuspensionen der Plaque-<br />
Elution die 1:500 und 1: 5000 Verdünnungen hergestellt und je 100 µl<br />
für die Infektion von XL1-Blue verwendet.<br />
(Prozedur wie am Vortag: Topagar aufschmelzen und 4 Röhrchen<br />
vorbereiten (ohne IPTG/X-Gal), 100 µl Phagen + 100 µl<br />
Bakteriensuspension)
<strong>DAGZ</strong>-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 10<br />
• Nach Ablauf der Inkubationszeit (BM25.8 + Phageneluate B bzw. K) werden je<br />
100 µl der Ansätze (bzw. Verdünnungen davon) wie folgt auf LB+Ampicillin<br />
plattiert (vom Tutor ausgegeben) und diese bei 37°C über Nacht inkubiert:<br />
TriplEx (B): 1:100 und 1:1000 Verdünnung, λgt10 (K) unverdünnt.<br />
Anmerkung: Die integrierten P1 und <strong>Lambda</strong> Phagen sind zwar bei 37°C „ungesund“ für unseren Wirt,<br />
daher wird die Vorkultur bei 30° geführt. Sobald di e Exzision erfolgt ist, ist es aber egal, wenn<br />
beispielsweise Selektionsdruck auf Mutation des P1-Phagen (Cre-Rekombinase) besteht.<br />
• Um Abschätzen zu können in welchem Verhältnis die E. coli Zellen zu Phagen im<br />
Exzisionsansatz vorliegen, ist durch Plattieren einer Verdünnungsreihe von<br />
BM25.8 auf Platten ohne Antibiotikum (restliche Bottom Agar bzw. LB) der Titer<br />
dieser E. coli Zellen zu bestimmen.<br />
Bitte geeignete Verdünnung überlegen, um auf vernünftige Zahlen zu kommen (100-<br />
300 Kolonien pro Platte): Faustregel: Eine stationäre Kultur hat gut 10 9 Zellen/ml.<br />
Hinweise für das das Protokoll:<br />
Teil A:<br />
Die Phagen-Plaques mit der Zählzwiebel auszählen (daraus Titer der Phagen-<br />
Stammlösungen berechnen, Vergleich mit dem angegebenen Titer. Beschaffenheit<br />
der Plaques (klar/trüb, eventuell Durchmesser, ungewöhnliches..) notieren. Für das<br />
Protokoll wichtig ist vor allem die Diskussion der Ergebnisse (Interaktion<br />
Phagengene/Wirtsgene: warum entstehen auf dem recA Wirt XL1-Blue keine<br />
Plaques mit rekombinantem EMBL3... Theorie und Praxis).<br />
Teil B:<br />
Bitte berechnen Sie:<br />
Wieviele Phagen befinden sich mindestens in einem Plaques (im gesamten Eluat des<br />
ausgestochenen Plaques)?<br />
Wieviele Phagen wurden zur Exzision eingesetzt, wieviele E. coli Zellen befanden<br />
sich im Ansatz?<br />
Wieviele Amp R -Kolonien wurden gezählt bzw. entstanden aus wievielen im Ansatz<br />
vorhandenen Phagen? Welche Effizienz für die Exzison ergibt sich daraus?<br />
Bei Unklarheiten bitte den Betreuer kontaktieren (Dr. Gerhard Adam, 01-47654-)<br />
6380, UFT Tulln) bzw. Tutoren fragen.<br />
Viel Erfolg!