V5 Fed-batch-Fermentation_Lipase

Stand WS 2012/2013
INTERDISZIPLINÄRES PRAKTIKUM 5. ÜBUNG
FED-BATCH-VERFAHREN ZUR GEWINNUNG VON LIPASEN
1. Grundlagen
1.1. Fermentation im fed-batch-Verfahren
Fed-batch-Verfahren zeichnen sich durch eine zeitlich begrenzte, kontinuierlich oder
in Intervallen erfolgende Zufütterung steriler Substrate ohne Entnahme von Nährlö-
sung aus dem Reaktor aus. Die spezifische Wachstumsrate µ einer fed-batch-Kultur
kann kontrolliert und durch die Substratzuflussrate erhöht oder gesenkt werden. Vor-
teile dieser Verfahrensweise liegen vor allem in einer vermehrten Biomassebildung,
der Umgehung von Katabolitrepressionen sowie, bei konstanter Drehzahl und Belüf-
tungsrate, der Vermeidung kritischer Sauerstoffpartialdrücke.
Großtechnische Anwendung finden fed-batch-Fermentationen z.B. bei der Herstel-
lung von Antibiotika wie Penicillin oder Cephalosporin, da hohe Raum-Zeit-
Ausbeuten und quasi Gleichgewichtsbedingungen ohne den hohen technischen
Aufwand der Führung von Chemostatkulturen erreicht werden können. Aber auch in
der Produktion von Enzympräparaten werden fed-batch-Fermentationen zunehmend
eingesetzt.
1.2. Lipasen
Lipasen [E.C.3.1.1.3; Triacylglycerol-Hydrolasen] erfüllen die Aufgabe, tierische und
pflanzliche Speicherfette und –öle zu hydrolysieren (s.u.). Sie sind daher universell in
Mikroorganismen und höheren Lebensformen verbreitet.
R2
O
O
O
H2C O R1
CH
C
H 2
O
O R3
+ 3 H 2 O
Lipase
R1
HO CH2OH CH +
CH2OH R2
R3
O
O
O
O
+ 3 H +
O
O
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Übung 5 – Fed-batch-Verfahren
Lipasen zeichnen sich durch hohe Temperaturstabilität sowie mehr oder weniger
ausgeprägte Spezifitäten aus, die sich auf die Art der Fettsäure oder Lipid-Klasse,
die Stereochemie oder die Position der Fettsäure im Lipid beziehen. Für organisch-
synthetische Anwendungen ist vor allem die Fähigkeit von Bedeutung, auch unter
extrem wasserarmen Reaktionsbedingungen, in praktisch wasserfreien Lösungsmit-
teln, aktiv zu werden. Dies ermöglicht nicht nur den Einsatz schwer wasserlöslicher
oder in wässrigem Milieu instabiler Substanzen, sondern auch die Umkehr der hyd-
rolytischen Fettspaltung. Auf diese Weise können natürliche Fette modifiziert und
synthetische Ester erzeugt werden. Von kommerzieller Bedeutung ist beispielsweise
die Synthese von Aromaestern, deren weltweiter Markt derzeit in einer Größenord-
nung von einigen 100 t/a liegt.
Die industrielle Produktion erfolgt überwiegend mit Hilfe von Schimmelpilzen, jedoch
sind auch unter Hefen der Gattung Candida bzw. Yarrowia einige sehr gute Lipase-
Produzenten zu finden. Die Fermentation erfolgt üblicherweise im Rührkessel, der
ansatzweise oder aber im Zulaufverfahren betrieben wird. Der Einsatz gentechnisch
veränderter Mikroorganismen zur Produktion geeigneter Lipase-Präparate unter-
schiedlichster Anwendung ist weit verbreitet.
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2. Methodik
Übung 5 – Fed-batch-Verfahren
Im Rahmen des Praktikums soll ein zur Bildung von Lipase befähigter Stamm von
Yarrowia lipolytica (Synonym: Candida lipolytica) im Kleinfermenter (Infors mit 1,5 L
Arbeitsvolumen) unter Anwendung eines fed-batch Verfahrens kultiviert werden. Re-
gelmäßige Probenahme dient zur Kontrolle des Wachstums und der Lipaseaktivität.
Der Lipasegehalt der Fermentationsbrühe wird aus dem Überstand einer zentrifu-
gierten Probe titrimetrisch bestimmt.
2.1 Vorkultur
Glucose 2 %
Hefeextrakt 1 %
Pepton 1 %
Leitungswasser ad 75 mL, Sterilisation, 20 min., 121°C
Es wird 1 x 75 mL Vorkulturmedium in einem 300-mL-EMK mit Schikanen angesetzt,
mit 2 Impfösen Yarrowia lipolytica DSM 3286 beimpft und für 24 h bei 30 °C auf ei-
nem Rotationsschüttler inkubiert.
2.2. Hauptkultur
Für die Fermentation im Kleinfermenter wird ein Startarbeitsvolumen von 1,3 L zu
Grunde gelegt. Die Menge des Produktionsmediums wird entsprechend berechnet,
wobei darauf zu achten ist, dass bei der Inokulation 75 mL Vorkulturbrühe in den
Fermenter eingebracht werden (1225 ml Produktionsmedium + 75 mL Vorkultur).
Produktionsmedium:
Malzextrakt 3,0 %
Olivenöl 0,5 %
MgSO4 Heptahydrat 0,1 %
K2HPO4 0,2 %
Harnstoff 0,1 %
Pepton 0,5 % (ROTH 8952.3)
Feed-Lösung:
80 mL Ethyloleat mit Leitungswasser ad 500 mL, Sterilisation 20 min, 121°C
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Übung 5 – Fed-batch-Verfahren
Vor dem Autoklavieren unbedingt einen Magnetrührstab zugeben, damit die Feedlö-
sung später ausreichend durchmischt werden kann!
Fermentationsbedingungen: Minifors von Infors
Belüftung O2-Steuerung bei 20% Luftsättigung, Kaskadensteuerung
Temperatur 30 °C
maximale Belüftung einstellen
pH-Wert 7,0; Regulation mittels 2 M NH3 und 1 M H3PO4
Ausgangsdrehzahl 100 Upm (bei O2-Steuerung) Infors: 100 – 1250 rpm Re-
gelbereich,
Antischaumregulierung, Abluft über eine Schaumauffangflasche leiten.
Durchführung der Fermentation:
Das Produktionsmedium wird im Fermenter autoklaviert. Amperometrische Sauer-
stoffelektroden müssen mindestens 6 Stunden im Fermentationsmedium äquilibriert
werden. Die Kalibrierung der Elektrode erfolgt bei maximaler Belüftung und 1000
rpm. Die optische Sauerstoffelektrode (Visiferm) kann direkt kalibriert werden.
Vor dem Animpfen des Fermenters wird eine Probe gezogen, die als Nullprobe für
den Bradford-Test dient. Die gesamte Vorkultur wird zum Animpfen verwendet und
unter den angegebenen Bedingungen 24 Stunden im batch-Verfahren kultiviert.
Dann wird weitere 24 Stunden lang Feed-Lösung mit einer Rate von ca. 12 mL/h
zugeführt, wobei darauf zu achten ist, dass die Feed-Lösung während der gesamten
Zeit auf einem Magnetrührer gut durchmischt wird. Dazu wird am Fermenter die För-
derrate 002 eingestellt.
2.3 Probenahme und Aufarbeitung
Zur Kontrolle des Wachstums werden während des batch-Betriebes eine Probe nach
Beimpfen, eine 2. Probe nach etwa 4 Stunden und eine 3. Probe vor Anschluss der
Feedlösung genommen, im Feedbetrieb verteilt zwei bis drei Proben, davon die letz-
te direkt vor Abbruch der Fermentation. Die Probennahme erfolgt, indem 10 mL der
Probe in einem ausgewogenen Falcon-Tube bei 4800 rpm (Hettich-Zentrifuge) ab-
zentrifugiert werden.
Vom entstandenen Überstand werden 6 mL Probe in Falcon-Tubes eingefroren (2
mL für den Bradford-Test und 4 mL für die Lipaseaktivitätsbestimmung).
Der Rest des Überstandes wird verworfen. Zur Entfernung des Olivenöls wird 1mL
Dioxan:Propionsäuregemisch (1:1) dazugegeben und mit den Bakterien resuspen-
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Übung 5 – Fed-batch-Verfahren
diert. Anschließend wird zentrifugiert und noch 2x mit 10 mL Leitungswasser gewa-
schen. Die Trocknung zur Gewichtskonstanz erfolgt bei 95 °C, das Endgewicht jeder
Probe wird notiert.. Die Aktivitätsbestimmung der Lipase erfolgt titrimetrisch, durch
Bestimmung der nach der Lipasereaktion freigewordenen Fettsäuremenge.
Durchführung der Titration:
Herstellung 0,001 M Tris-HCl –Puffer pH 7,0: jede Gruppe 1 L
• Lsg. A 0,1 M HCl Lsg.
d.h. 0,98 mL 32% HCl auf 100 mL A. dest.
• Lsg. B 0,2 M Tris-Lsg. (MM: 121, 14 g/mol)
d.h. 2,4228 g Tris auf 100 mL A. dest.
Puffer:
pH 7,0: 46 mL Lsg. A
+ 25 ml Lsg. B
(Verdünnung in Gesamtlsg. 1:4 Endkonz. Tris 0,05 M) auf 100 mL mit entionisiertem
Wasser auffüllen 20 mL von Puffer auf 1 L mit A. dest. auffüllen (Endkonz.
Puffer 0,001m)
Substratlösung für Aktivitätstest
150 mL 12,5%ige Gummi arabicum-Lösung (w/v) in 1 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0 +
50 mL Olivenöl emulgiert unter Verwendung eines Ultra-Turrax. PH-Wert nach Zugabe
von Olivenöl (ca. pH 4,7) mit ca. 5-10 mL 0,2 M Tris-Lösung auf pH 7,0 eingestellt.
Herstellung 0,05 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 : 100 ml für Proben aller
Gruppen
• Lsg. 1: 100 ml 0,05 M K2HPO4 (MM: 174,18g/mol)
d.h. 0,8709 g K2HPO4 auf 100 mL entionisiertes Wasser
• Lsg. 2: 100 ml 0,05M KH2PO4 (MM: 136,09g/mol)
d.h. 0,6805g KH2PO4 auf 100 ml entionisiertes Wasser
Puffer:
pH7,0: 61 mL Lsg. 1
+ 39 mL Lsg. 2
Lipase (1,14U/mg)
0,219 g in 20 mL Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 werden als Test eingesetzt (Verdünnung
1:100)
Ablauf der Titration
1) Titrationsapparatur anschalten
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2) Bürette mit 0,1 M KOH spülen
Eingabe der folgenden Sequenz am Controlpanel:
ESC
INIT
SYS (auf dem Display mit Pfeiltasten auswählen)
FILL
Übung 5 – Fed-batch-Verfahren
Dann das Bürettenrohr nach oben halten, damit die Luft entweichen kann und
keine Blasen im Rohr verbleiben.
STOP
3) Kalibration der pH-Elektrode
Eingabe am Controlpanel:
CAL
START
Auf dem Display erscheint „4“. Elektrode mit Aqua dest. abspülen und in die
Kalibrationslösung (pH 4) tauchen, dabei mit Hilfe des Magnetrührers rühren.
Warten bis das Display anzeigt, dass der Messwert konstant bleibt und die
Anzeige auf „7“ umspringt. Dann die Elektrode erneut mit Aqua dest. spülen
und in die Kalibrationslösung (pH 7) eintauchen. Wie beschrieben verfahren.
Am Ende die Elektrode erneut abspülen und zurück in KCl-Lagerflüssigkeit
stellen.
ESC (auf dem Display erscheint das Lipase Programm)
4) Titration
14 ml der Substratlösung (sollte vor den Messungen aufgrund ihrer Instabilität
frisch angesetzt werden) zusammen mit einem Rührfisch in ein kleines Becherglas
(25 ml) geben. Bürette und pH-Elektrode einhängen und am Controlpanel
START
eingeben. Während der 20 sec Wartezeit (Display beachten) 1 mL der abzentrifugierten
Probe zugeben und Stoppuhr starten. Nach Ablauf der Wartezeit
startet die Titration.
Alle 15 sec muss der auf dem Display angezeigte Wert der Base-Zugabe (Volumen)
notiert werden (oder direkt in Excel eingegeben werden). Die Titration
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Übung 5 – Fed-batch-Verfahren
läuft über 15 min. Die Werte sollten sofort in einem Excel Graphen aufgetragen
werden. Es soll verfolgt werden, ob die aufgezeichnete Kurve der KOH-
Zugabe eine Gerade ergibt. Ist dies der Fall, kann die Steigung dieser Geraden
ermittelt und damit die Aktivität berechnet werden. Ergibt sich kein linearer
Zusammenhang oder kann auch durch ständige KOH-Zugabe der pH-
Wert nicht konstant gehalten werden, muss die Probe entsprechend verdünnt
und der Test wiederholt werden. Zum Abbruch und Neustart der Methode
STOP
STOP
ESC
drücken. Vor Beginn der nächsten Messung müssen pH-Elektrode, Titriervorrichtung
und Reaktionsgefäß mit Aqua dest. abgespült werden.
Umrechnung des Verbrauchs an KOH in Lipaseaktivität:
Die in einer Excel-Tabelle aufgenommenen Werte in einem Punktdiagramm anzei-
gen lassen (KOH Verbrauch in mL gegen Zeit in sec auftragen). Die Werte den line-
aren Bereichs in einem neuen Diagramm anzeigen, eine Trendlinie einfügen und die
zugehörige Geradengleichung anzeigen lassen. Dann aus der Gleichung die Stei-
gung der Geraden ablesen.
Berechnung der Volumetrischen Aktivität:
1 mL 0,1 M KOH = 100 µmol freie Fettsäuren
1 U/mL = 1 µmol Fettsäuren/ (mL Probe x min)
Volumetrische Aktivität (U/mL) = Steigung * 60 (Umrechnung auf min) * 100 (da
100 µmol freie Fettsäuren) * Verdünnungsfaktor / Probenvolumen in mL
Beispiel:
Bei Geradengleichung 0,0049x + 1,8994 ergibt sich:
Vol. Aktivität = 0,0049/sec * 60 * 100 µmol freie Fettsäuren/mL * 2 (für Verdünnung 1 : 2)
= 58,8 µmol freie Fettsäure/mL Probe * min = 58,8 U/mL
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Berechnung der Spezifischen Aktivität:
Übung 5 – Fed-batch-Verfahren
Spezifische Aktivität (U/mg) = Volumetrische Aktivität pro mg Protein/ mL
Die Proteinbestimmung erfolgt spektrophotometrisch mittels des Bradford-Tests. Sie
beruht auf der Bindung des ionischen Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G-250 an
basische Aminosäuren, wobei das Absorptionsmaximum des Farbstoffs von 465 nm
zu 595 nm verschoben wird. Die Absorptionsänderung bei 595 nm wird im Spektral-
photometer erfasst und die Proteinkonzentration anhand einer Kalibriergeraden be-
stimmt. Zur Erstellung der Kalibriergeraden werden BSA- (Bovine Serum Albumine)
Lösungen von 20 µg/mL, 15 µg/mL, 10 µg/mL, 5 µg/mL und 0 hergestellt (BSA bitte
mit Handschuhen und Mundschutz handhaben!). Für Kalibriergerade und Test wer-
den je 800 µL Proteinlösung in einer Küvette mit 200 µL Bradford-Reagenz (Protein
Assay, Biorad) versetzt, kurz vermischt, 7 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und
photometrisch vermessen. Liegen die ermittelten Proteinkonzentrationen (Absorptio-
nen) außerhalb des kalibrierten Bereiches, müssen sie vor der Zugabe zum Brad-
ford-Reagenz geeignet verdünnt werden. Die Verdünnungen sind bei der Berech-
nung der Proteingehalte der Proben sowie der spezifischen Lipaseaktivität zu be-
rücksichtigen.
Auswertung
Die Zunahme der Zellmasse sowie die volumetrischen und spezifischen Lipaseaktivi-
täten über die Zeit werden graphisch verdeutlicht und interpretiert. Für die batch-
Phase der Fermentation sind die Wachstumsphasen zu ermitteln und die durch-
schnittliche Wachstumsrate der fed-batch Phase anzugeben. Zusätzlich sollen in
einem gemeinsamen Diagramm die Abhängigkeiten von Lipase-Produktion und
Wachstum veranschaulicht, sowie die Fermenterproduktivität ermittelt werden.
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