Protokoll Oberascher und Handlechner

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Protokoll
Bachelormodul: Biologische
Arbeitsmethoden MOD.200
WS 2012
(Übungsteil Handlechner Astrid, Oberascher Karin 29-31.10.2012)
Modulverantwortlicher:
Ao.Univ.-Prof. Dr.rer.nat. Pfeiffer, Wolfgang
Leiter der Übung
Handlechner Astrid & Dr.phil.Oberascher Karin
Schriftführer:

1. Abkürzungen:
FKS = fetales Kälberserum
PDL = Poly-D-Lysin
HVP = H2O-Vakuumpumpe
GZR = Grainer/Zentrifugierröhrchen
PBS = Phosphate buffered saline
MW = Moleculare Weight
DAPI = 4′,6-Diamidin-2-phenylindol
EDTA= Ethylendiamintetraessigsäure
DMSO= Dimethylsulfoxid
CsCl= Cäsiumchlorid
2. Erster Kurstag, Montag 29.10.2012
2.1. Kennenlernen und vertraut machen mit den Geräten und Räumen:
2
Am Anfang wurden alle Studenten in zweier Gruppen eingeteilt, je zwei Gruppen auf eine
Kursleiterin. Die Kursleiterinnen gaben eine kurze Einführung in das sterile Arbeiten im
Labor 1 das Labor selbst und die zu verwendenden Geräte wie Brutschrank (37°C, 5, CO2
Sättigung), Wärmebad, Inverses Mikroskop, Zentrifuge, Sterilbank Klasse 2. Des Weiteren
wurden der Dampfsterilisator (Betriebstemperatur liegt bei ca. 120° C- 125° C und 1,5 bar)
und der Heißluftsterilisator(Betriebstemperatur ca.160° C) angesehen. Bei beiden Geräten
ist darauf zu achten, Indikatorband für die zu sterilisierenden Objekte zu verwenden. Der
Heißluftsterilisator wird insbesondere für Glas und Metall Instrumente verwendet, wie auch
beim Dampfsterilisator muss man die Anheizphase und Ausgleichszeit (Sterilisationsgut muss
sich auf Sterilisationstemperatur erwärmen) bedenken.
1 (vgl. Skript Oberascher & Handlechner. 2012 S. 2)

3
Als erste Übung wurden wir mit dem Umgang sog. Pipetus vertraut gemacht, dazu sollten
wir verschiedene Volumina aufziehen und wieder ablassen. Diese Arbeitstechnik dient als
Grundlage für die von den Studenten durchzuführenden Experimenten. Im Kurs werden mit
C6-Zellen (Gliazellen) gearbeitet, diese wurden aus Glioblastom der Ratte gewonnen
2.2. Medium für C6 Zellen erstellen:
Bevor in dem Labor gearbeitet werden kann, müssen die Hände ordnungsgemäß gewaschen
werden und Latex-Handschuhe angezogen werden, außerdem müssen die Hände vor der
Arbeit in der Clean-bench mit 70% Ethanol gesäubert werden. Auch die Clean-bench selbst
wird vor der Arbeit mit 70% Ethanol gereinigt. Diese Schritte sind notwendig um eine
Kontamination mit Keimen, Mycoplasmen, Viren etc. zu vermeiden alle folgenden Arbeiten
folgen diesen Richtlinien und Abläufen des sterilen Arbeitens.
Zellen brauchen zum Wachstum ex vivo Medien, diese Medien enthalten Aminosäuren,
Salze, Vitamine, Spurenelemente sowie Phenolrot als pH Indikator, Bicarbonat zu Pufferung
und weitere Bestandteile. Zu einem vorgefertigten Medium 2 , sollten noch 8,8% Fetales
Kälberserum (FKS) hinzugefügt werden. Serum wird in der Zellkultur als Aminosäure-,
Phytohormon- bzw. Hormon-, Wachstumsfaktoren, Spurenmineralien-Spender und Spender
für viele weitere unbekannte Stoffe verwendet, diese Grundlage bedingt optimale
Wachstumsbedingungen für die kultivierten Zellen. Es gibt auch Serumfreie Medien die den
Vorteil haben definiert in ihrer Zusammensetzung zu sein, was für gewisse Experimente
notwendig ist. Phenolrot dient wie beschrieben als pH Indikator, dabei ist Rot (pH 7,4) oft die
ideale Farbe. Ein Farbumschlag ins gelbe (pH 6,5) weist auf eine bakterielle Kontamination
oder zu viel CO2 im Inkubator hin. Ein Farbumschlag ins violette hingegen auf eine
Kontamination mit Pilzen bzw. Hefen oder zu wenig CO2 im Inkubator.
Anmerkung: Das Öffnen von Behältern, Gläsern, Röhrchen usw. geschieht in der clean-bench
ausschließlich in Schräglage, die Deckel werden seitlich so im hinteren Bereich aufgestellt,
2 Gibco, F-10 Nut Mix (Ham)(1x), 500ml

4
dass sie die Arbeit nicht behindern. Die gefertigten Medien werden zum Schluss noch mit
Datum, Kürzel des Experimentators und Information über Zusammensetzung (8,8% FKS)
versehen um einem Vertausch vorzubeugen. Im Versuch werden unter der clean-bench
(Sicherheitsklasse 2) steril mit dem Pipetus und einer 50 ml Pipetten-Spitze 228 ml von
einem vorgefertigten Medium in eine neue Glasflasche gegeben, dazu kommen 22 ml des
FKS mit einer 10 ml Pipette. Durch mehrmaliges auf und abziehen mit der Pipette wird
durchmischt.
2.3. C6-Zellen füttern:
Zellen in Kultur verbrauchen Nährstoffe und so fallen auch Stoffwechselprodukte an. Damit
den Zellen genügend Nährstoffe zur Verfügung stehen und die Stoffwechselprodukte nicht
inhibierend oder gar toxisch wirken können, müssen Zellen ein- bis zweimal pro Woche
gefüttert werden.
An den Vakuumschlauch der H2O-Vakuumpumpe wird unter der Lamina-Flow eine zuvor mit
Heißluft sterilisierte Pasteurpipette angeschlossen. Damit wird das alte Medium abgesaugt,
danach werden 5 ml des angesetzten Mediums zu den Zellen dazu geben. Die Zellen
befinden sich adhärent an dem Boden der Flaschen, deswegen sollte man möglichst nicht
mit der sterilen Pasteurpipette darüber streifen. Die Zellen werden danach sofort wieder in
den Inkubator (37°C, 5% CO2) gegeben. Der Deckel darf dabei nie ganz verschlossen werden
da sonst kein CO2-Austausch stattfinden kann. Dieser Vorgang wird für 6
Zellkulturfläschchen wiederholt. Am Ende der Arbeit mit der Vakuumpumpe wird der
Schlauch mit Leitungswasser gespült und die verbrauchten Pasteurpipetten in den extra für
Glasabfall vorgesehen Behälter entsorgt.
2.4. Poly-D-Lysin Herstellung:
Um die Zelladhäsion auf Oberflächen zu verbessern gibt es verschiedene Beschichtungen,
z.B. Fibronectin Beschichtung, Laminin, Kollagen und Poly-D-Lysin (PDL). Poly-D-Lysin ist eine

5
synthetische Aminosäurekette mit positiver Ladung, die Zelladhäsion und Proteinabsorption
durch eine Änderung der Oberflächenspannung auf dem Kulturträger verbessert.
Oberflächenbehandlungen mit Poly-D-Lysin unterstützen Anwendungen wie die Anhaftung
und Verbreitung verschiedenster Zelllinien, die Zelldifferenzierung und Neuritauswüchse, die
Anhaftung transfizierter Zelllinien und das Überleben von Primärneuronen in der Kultur. Da
es synthetisch ist, stimuliert es die biologische Aktivität der auf ihm kultivierten Zellen nicht,
und gibt im Gegensatz zu natürlichen Polymeren keine Verunreinigungen ab. 3
Die Gebrauchslösung soll eine Konzentration von 1:100 haben, bei einer
Stammlösungskonzentration von 1 % Poly-D-Lysin 4 . Hierfür werden zuerst 100 ml Millipor-
Wasser in ein neues Becherglas pipettiert und 1 ml wieder abgenommen. Auf dieses
Volumen wird nun 1 ml 1 % Poly-D-Lysin hinzugegeben, was zu der gewünschten
Konzentration von 0,01% führt. Dieser Schritt wird deshalb so gemacht, da die 100 ml mit
einem Messkolben abgemessen wurden. Aus der Lösung wird danach in 8
Plastikreagenzgläser (a 14 ml) steril abfiltriert. Bei der Gruppe Wittmann/Seidel waren es nur
6, da zwei Filter undicht waren. Sterilfiltration funktioniert so, dass das Filtrat durch eine
Cellulose Membran mit einer Porengröße von 0,02 μm, gepresst wird. Alles was einen
größeren Durchmesser hat als die Porengröße wird von der Membran zurück gehalten. Die
gefüllten Zentrifugenröhrchen werden mit Datum, Inhalt, und Kürzel versehen und sind für
längere Zeit haltbar.
Am Ende des Kurstages wurde die Clean-bench mit 70% EthOH gereinigt. Es wurde von
hinten nach vorne gereinigt um etwaige Verschmutzungen nicht in Ecken zu schieben, die
schwieriger zu reinigen sind und um nicht die im hinteren Bereich befindlichen Geräte zu
verschmutzen. Die Hände wurden vor dem Verlassen des Labors wieder gewaschen.
3. Zweiter Kurstag, Dienstag 30.10.2012
Anmerkung: Die folgenden Arbeitsschritte folgen diesen Richtlinien und Abläufen des
sterilen Arbeitens. Des Weiteren wurde vor Arbeitsbeginn verfahren wie am 29.10.2012
unter „2. Medium für C6 Zellen erstellen“ erklärt wurde
3 vgl. https://de.vwr.com/app/catalog/Product?article_number=734-0146
4 Poly-D-Lysine hydrobromide (10ml Auqa bidest. = 1%) von 29.10.2012

3.1. Deckgläser mit Poly-D-Lysin beschichten:
6
Pro Teilnehmer wurde zwei Petrischalen (36 mm Durchmesser) ausgegeben, welche mit C6
(Passagennummer 10), Kürzel des jeweiligen Teilnehmers und Datum beschriftet wurden.
Unter der Lamina-Flow kamen in die Petrischalen mit einer zuvor abgeflammten Pinzette je
vier sterile Deckgläser (12 mm Durchmesser). Sie werden so angeordnet, dass sie sich nicht
gegenseitig überlagern. Danach werden in die Petrischalen 2 ml der am Vortag hergestellten
PDL Lösung pipettiert, diese müssen dann 15 min bei Raumtemperatur inkubiert werden
damit das PDL an der Oberfläche haftet. Nach der Inkubationszeit wird das PDL mit einer
H2O-Vakuumpumpe abgesaugt und die Deckgläser in den Petrischalen mit 2 ml bidest. H2O
gewaschen. Für die DAPI-Färbung wird eine bestimmte Zellkonzentration benötigt, deshalb
wird ein Zwischenschritt „3.2.Bestimmung der Zellzahl und Aussähen der Zellen“ eingefügt.
3.2. Bestimmung der Zellzahl und Aussähen der Zellen:
Die Zellzählung ist eine Routinemethode, die entweder wenn man standardisiert arbeitet
bei jeder Passage, oder aber wenn Abkürzungen erlaubt sind nur anfänglich durchgeführt
wird und zwar so lange, bis man das Wachstumsverhalten seiner Zelllinie(n) kennengelernt
hat. 5 Auch hier erhöht sich die Passagenzahl um 1, hier von 9 auf 10.
C6-Zellen werden aus der Kulturflasche mit Trypsin-EDTA abgelöst. Trypsin ist eine
Serinprotease und spaltet als Endopeptidase vorwiegend nach basischen Aminosäuren
dadurch kann sich der Zellrasen von der Kulturflasche lösen. Sein Wirkungsoptimum liegt bei
einem pH von 7 bis 8. Zellen dürfen nicht zu lange mit Trypsin in Berührung kommen, da
sonst weitere Proteine gespalten werden, dies hätte letale Folgen für die Zellen. Eine andere
Möglichkeit, Zellen abzulösen ist sie mit einem Spatel abzuschaben.
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ist ein Chelatbildner, d.h. es ist der Lage doppelt-
positiv geladene Ionen zu binden, da Mg 2+ ein Membranstabilisationsion ist und somit die
Zelladhäsion erhöht wird eine Trypsin/EDTA Lösung zu den Zellen hinzugegeben.
5 Zit. Sabine Schmitz, Der Experimentator: Zellkultur 3. Auflage, Heidelberg 2011 S. 206

Zellen werden aus Inkubator an die Studenten ausgeben, dann wird das Medium mit der
7
HVP abgesaugt. Um den Zellrasen zu lösen werden 2 ml 37°C warmes Trypsin/EDTA (bei der
Temperatur ist das Enzym aktiver) in die Kulturflasche pipettiert. Die Lösung wird für ein
paar Sekunden stehen gelassen und durch leichtes klopfen auf den Boden der Kulturflaschen
werden die letzten Zellen abgelöst. Zur Kontrolle wird die Kulturflasche gegen das Licht
gehalten und überprüft, ob sich die Zellen vollständig gelöst haben (wenn Zellen gelöst, ist
die Suspension milchig, man kann dies aber auch unter dem inversen Mikroskop
kontrollieren). Danach werden 7 ml Medium 6 in die Pipette gezogen und die restlichen 2 ml
Trypsin/EDTA/Zellen ebenfalls aufgezogen. Die nun gewonnene Lösung wird in ein
Zentrifugierröhrchen (15 ml) überführt. Die Lösung wird abzentrifugiert (22°C, 5 min, 200g),
es ist zu beachten, dass das Gewicht der Lösung austariert werden muss, um Schäden an der
Zentrifuge zu vermeiden und das Gerät zu schonen. Dazu wird ein weiteres GZR mit dem
gleichen Gewicht (mit Präzisionswaage bestimmt) in die Zentrifuge gestellt. Der Überstand
wird abgeschüttet und das Pelett mit ca. 2 ml Medium durch mehrmaliges auf und abziehen
mit der Pipette resuspensiert. Die Resuspension sollte rasch erfolgen, da Zellen im Pelett
hypoxisch sind. C6-Zellen halten mehrere Minuten in diesem Zustand aus, andere sind
jedoch sensitiver.
10 μl Zellsuspension werden in ein Mikroreaktionsgefäß pipettiert und mit 10 μl
Trypanblau 7 vermischt .Bei dem sauren Farbstoff Trypanblau (syn. Benzaminblau) handelt es
sich um einen Vertreter aus der Gruppe der Azofarbstoffe, dessen Anion an Zellproteine
bindet. Die Trypanblau-Färbung ist eine Ausschlussfärbung, denn der Farbstoff dringt
selektiv nur in tote Zellen ein. Deren Membran ist durchlässig geworden, sodass der
Farbstoff in das Cytoplasma gelangen kann. Trypanblau wird von lebenden Zellen nicht
aufgenommen, da er aufgrund seiner Größe (M = 960,8 g/mol) die intakte Membran
lebender Zellen nicht passieren kann. 8 Beim Arbeiten mit Trypanblau, ist Vorsicht geboten da
es karzinogen ist. 9 . Da es zusätzlich zytotoxisch ist, muss die Auszählung unmittelbar danach
erfolgen. Mit einer Pipette und einem Deckglas als Hilfsmittel wird die Trypanblau/ Zell-
Lösung auf die eine Neubauerzählkammer pipettiert. In 6 Zentralfelder plus die obere und
6
am Tag zuvor vorbereitet
7
Sigma: Trypan blue Solution (0,04%), prepared in 0,81 % Sodium chloride and 0,06%
Potassium phosphate; dibasic (100ml)
8
Zit. Sabine Schmitz, Der Experimentator: Zellkultur 3. Auflage, Heidelberg 2011 S. 206
9
Vgl. http://www.applichem.com/de/shop/produktdetail/as/trypanblau-ci-23850/

die linke Seitenkanten der Neubauerzählkammer werden die lebenden (lebende sind
leuchtend hell, tote erscheinen blau) ausgezählt. Danach wird nach folgendem Ansatz auf
die Gesamtzellzahl hochgerechnet:
8
Kleinstquadrate werden gemittelt x 25 (Gesamtquadrate) x 2 (Verdünnungsfaktor von
Trypanblau) x 10^4 (Zellfaktor)
Ergebnisse: Dennis Wittmann/Peter Seidel:
Dennis Wittmann: 10 Zellen in 6 Kleinstquadraten
Peter Seidel: 13 Zellen in 6 Kleinstquadrate
= 83,333 x Zellen
= 108,333 x Zellen
Diese Werte werden für die DAPI-Färbung benötigt, damit man das Volumen für 8 x 10^4
Zellen in 2 ml aus den errechneten Zellzahlen erhält.
Das benötigte Volumen kann man mit Umformung der allgemeinen Formel: c1 x V1 = c2 x V2
->
ermitteln, am Ende muss jedoch das Ergebnis mal 2 genommen werden, da
die Zellzahl auf zwei ml gerechnet worden ist und nicht auf einen.
Dennis Wittmann:
V1=
= 0,192 ml = 192 μl x 2 = 384 µl

Peter Seidel:
V1 =
9
= 0,147ml = 147 μl x2 = 294 µl
Diese Volumina werden nun mit 2 ml des vorgefertigten Mediums auf die vorbereiteten
Deckgläser in den Petrischalen (30.10.2012 1. Deckgläser mit Poly-D-Lysin beschichten)
gegeben und bis zum nächsten Tag im Brutschrank bei 37° C und 5 % CO2 inkubiert.
3.3. PBS-Puffer ansetzen:
Phosphatgepufferte Salzlösung ist eine isotonische Lösung die für viele Bereiche
Verwendung findet, wie z.B. Waschen von Zellen und Transportieren von Zellen 10 . Die
Lösung wird gänzlich ohne Mg 2+ und Ca 2+ angesetzt, da diese Proteine der extrazellulären
Matrix stabilisieren würden und ein Ablösen mit Trypsin erschweren würden.
Mit den Chemikalien Na2HPO4 (8mM) 11 , NaCl (149mM) 12 , K2HPO4 (2mM) 13 sollen 250 ml
Lösung mit pH 7,4 hergestellt werden.
NaCl: (gewünschte Konzentration 149 mM auf 250 ml )
(58,44 g/M : 1000) x 149 mM = 8,70 g
8,70g : 4 = 2,17g/ 250 ml
10 Vgl. http://www.invitrogen.com/1/3/pbs-buffer
11 Sigma Chemical Co. , MW = 142 g/ mol
12 Sigma Chemical Co. , MW = 58,44 g/ mol, 99% Reinheit
13 Riedel-de-Haën, MW = 136,1 g/mol, 98-100 % Reinheit

10
K2HPO4: (gewünschte Konzentration 2 mM auf 250 ml)
(136,1 g/M : 1000) x 2 = 0,27 g
0,27 g: 4 = 0,068 g/ 250 ml
Na2HPO4: (gewünschte Konzentration 8 mM auf 250 ml)
(142g/ M : 1000) x 8 mM= 1,136 g
1,136 g : 4 = 0,284 g / 250 ml
Folgende Arbeitsschritte wurden sauber, aber nicht steril und nicht unter der Clean-bench
durchgeführt.
Die Mengen wurden mit einer Präzisionswaage eingewogen und durch Rühren mit einem
Magnetrührer in 250 ml bidest. H2O gelöst. Da der ph-Wert bei diesem Puffer zwischen 7,2-
7,4 liegen soll (dieser pH liegt auch im menschlichen Blut vor), wurde der pH mit einem pH-
Meter gemessen. Diese Messung zeigte einen pH-Wert von 7,48 bei einer Temperatur von
23°C. Der pH wurde mit 1M HCl korrigiert auf 7,3. Die Elektrode des pH-Meters wird nach
Gebrauch in eine 3M KCl-Lösung gelagert. Der erstellte PBS-Puffer wurde in eine Glasflasche
abgefüllt und beschriftet.
3.4. C6 Zellen Passagieren:
Zellen nehmen Nährstoffe auf, wachsen und teilen sich, würde man sie in Kultur nicht
Splitten käme es zu 100 % Konfluenz. Diese Konfluenz brächte einen Zellteilungsstop durch
Kontaktinhibition, Ablösen und Zelltod mit sich, deswegen muss 1-2 pro Woche Passagiert
werden. Bei jedem Mal Passagieren erhöht sich die Passagenziffer um 1, bei uns von Passage
9 auf Passage 10.

11
Zwei sterile Kulturflaschen werden mit Name, Passagenummer (P 10) und Datum beschriftet
in die Clean-bench gestellt. Die Zellen werden nach dem gleichen Schema wie in
„2.Bestimmung der Zellzahl „ beschrieben abgelöst, zentrifugiert und das Pellet gelöst. In die
Kulturflaschen werden jeweils 5 ml des hergestellten Mediums mit der Pipette vorgelegt. In
eine Kulturflasche werden 2 Tropfen Zellsuspension in die andere 5 Tropfen Zellsuspension
gegeben, um den Unterschied der Zellkonzentration überprüfen zu können, denn in der 5
Tropfen Flasche würde man mehr Zellen erwarten. Bevor die Zellen in den Inkubator
kommen, wird mit einem Mikroskop überprüft, ob Zellen in den Kulturflachen vorhanden
sind. Dies ist bei allen der Fall und man kann nun schon deutlich den Unterschied zwischen
den 5 und 2 Tropfen-Flaschen sehen.
3.5. Verdünnung und Auftragen der CsCl-Lösung :
Cäsiumchlorid (CsCl) löst Apoptose in den Zellen aus. Es soll zwei Lösungen CsCl mit 30 mM
und 15 mM aus einer Stammlösung von 500 mM 14 hergestellt werden um unterschiedliche
Apoptose Stadien zu generieren. Nach einem einfachen Rechenansatz c1 x v1 = c2 x V2
wurde die benötigte Menge bestimmt:
1. 30 mM
500 mM x V1 = 30 mM x 10 ml
V1 = 600 µl
2. 15 mM
500mM x V1 = 15 mM x 10 ml
V1 = 300 µl
10 ml des am 29.10.2012 hergestellten Mediums werden vorgelegt und 600 μl abpipettiert
und darauf wieder die berechneten 600 μl CsCl-Lösung (30mM) pipettiert. Anmerkung: Der
Verdünnungsschritt wurde im Labor vereinfacht, um Pipetten zu sparen. Für die 15 mM-
14 Stammlösung wurde von der Kursleiterin hergestellt

12
Lösung werden 4 ml von der 30mM-Lösung mit Medium verdoppelt. Die Lösungen werden
beide durch 20 µm Cellulose Membranen steril in Zentrifugenröhrchen filtriert.
Drei der vorbereiteten Petrischalen mit 4 Deckgläsern (siehe 1.Deckgläser mit Poly-D-Lysin
beschichten) werden mit jeweils 2 ml 15 mM andere drei mit 2 ml 30 mM CsCl- Lösung
versetzt und 2 als Kontrolle ohne CsCl nur mit Medium angelegt. Die Petrischalen werden
über Nacht (ca. 18h, besser wäre eine längere Inkubationszeit) im Brutschrank bei 37°C und
5 % CO2 inkubiert.
3.6. Einfrieren von Zellen:
Jeder in der Gruppe sollte 3 Kryoröhrchen mit Zellen für das Einfrieren bei -70°C anlegen. Die
Röhrchen werden zunächst mit Datum, Kürzel und Zelllinie beschriftet. Bevor die Zellen
eingefroren werden können, muss zu den Zellen Dimethylsulfoxid (DMSO, 10%) 15
hinzugefügt werden. DMSO ist ein Kryoprotektiva und sorgt für ein gleichmäßiges Einfrieren
der Zellen, es verhindert auch das H2O in den Zellen ausfällt und Eiskristalle bildet, diese
würden die Zelle durch die Ausdehnung des H2O bei niedrigen Temperaturen zum Platzen
bringen. DMSO hat den Vorteil Zellen schnell zu penetrieren, nachteilig ist seine Toxizität. 16
Ohne Gefrierschutzmittel wie Glycerin, Sucrose und DMSO ist keine Kryokonservierung
möglich. Um die gewünschte Prozentzahl von 10 zu bekommen, werden 9 ml Medium (vom
29.10.12) pipettiert und 1 ml DMSO steril durch einen 20 µm Cellulose Filter hinzugefügt.
Pro Teilnehmer wird eine Flasche mit C6-Zellen wie unter „3.2.Bestimmung der Zellzahl“
beschrieben abgesaugt, trypsiniert und zentrifugiert, wobei sich die Passagenzahl um eins
erhöht. Diesmal Jedoch wird das entstandene Pellet in 5 ml der DMSO-Lösung (eisgekühlt)
resuspendiert, davon werden 1 ml in die Kryröhrchen pipettiert. Diese werden sofort auf Eis
gelegt und unverzüglich in einer Styroporbox in den -70°C-Froster gelegt. In diesem Zustand
sind die Zellen je nach Art ca. 1-2 Jahre haltbar. Die Styroporbox isoliert und sorgt somit für
ein gleichmäßig erkalten des inneren von ca. 1°C pro Minute. Um eine Kristallbildung zu
15 Sigma; Dimethyl-Sulphoxide (DMSO) Hybri.MAX® Exp. 06/2014
16 Vgl. http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/
d5879pis.Par.0001.File.tmp/d5879pis.pdf

13
vermeiden, darf der Gefrierschrank 2 Stunden nicht geöffnet werden. Hierbei erhöht sich die
Passagenzahl von 9 auf 10.
Am Ende wurde der Arbeitsbereich mit 70% ETOH gesäubert und verwendete Pipetten und
Pasteurpipetten ordnungsgemäß entsorgt und die Hände vor Verlassen des Labors
gewaschen.
4. Dritter Kurstag, Mittwoch 31.10.2012
4.1 Methanol-Eisessig herstellen:
Methanol-Essigsäure-Gemisch dient in der Zellkultur der Fixierung der Zellen, wobei
Methanol die Proteine dehydriert. Zudem ist Methanol ein Zellhärtungswirkstoff, die
Essigsäure dagegen fungiert als Weichmacher und denaturiert die Proteine ohne deren
Quervernetzung zu bewirken. Je nach Mischungsverhältnis kann die Zellmembran gehärtet
oder aufgeweicht und damit die Spreitung der Chromosomen beeinflusst werden 17 .
Unter einem Abzug wird ein 3:1 Lösung von Methanol-Eisessig hergestellt, hierbei wird
sauber mit Handschuhen gearbeitet, jedoch nicht steril. Das Endvolumen soll 20 ml
betragen, damit genug für alle Teilnehmer vorhanden ist. Mit dem Pipetus werden zuerst 15
ml Methanol 18 und 5 ml Eisessig 19 in eine Glasflasche gegeben, diese wird mit Datum,
Konzentration (3:1) und Kürzel des herstellenden Teilnehmers versehen und unter dem
Abzug verwahrt. Es versteht sich, dass für beide Substanzen unterschiedliche Pipetten
verwendet werden.
17 vgl. Sabine Schmitz, Der Experimentator: Zellkultur 3. Auflage, Heidelberg 2011 S. 218
18 Methanol: Carl-Roth GmbH 99,9 % P.A. ; MW: 32,04
19 Eisessig: Carl-Roth GmbH 100% P.A; MW : 60,05

4.2 Kontrollproben der Deckgläser im Inversen Mikroskop betrachten:
Da sich die Zellen (C 6) im Brutschrank des Labors befinden, werden vor Entnahme die
14
Hände gewaschen, Latex-Handschuhe angezogen und mit 70% Ethanol gesäubert. Die Zellen
werden schnell aber behutsam aus dem Brutschrank genommen um zu gewährleiste, dass
die Temperatur (37° C) und der C02 Gehalt (5 %) nicht zu stark sinken.
Die Zellkonzentration ist kaum verändert, da sie erst am Vortag angesetzt wurden, kein
Deckglas ist kontaminiert.
4.3 Zellen waschen und für DAPI- Färbung vorbereiten:
Gearbeitet wird in diesem Abschnitt ebenfalls mit Latex-Handschuhen, sauber, aber nicht
steril. Die am Vortag vorbereiteten Deckgläser (siehe „3.2.Bestimmung der Zellzahl und
Aussähen der Zellen“) mit den nun adhärenten Zellen werden in ihren Petrischalen dreimal
mit 2 ml PBS gewaschen, dafür wird zuerst die CsCl- Lösung mit einer Pipette abgesaugt
ohne die Deckgläser zu berühren und somit Zellen zu beschädigen. Beim letzten
Waschschritt werden die 2 ml PBS erst unter dem Abzug abgesaugt und entsorgt. Mit einer
neuen Pipetten Spitze werden 2 ml Methanol- Eisessig zur Fixierung der Zellen sowie
dehydrieren der Proteine auf die Deckgläser gegeben ohne dass diese abschwimmen. Nach
ca. 15 Minuten wird der Methanol-Eisessig unter dem Abzug abgesaugt und wie die
verwendete Spitze in einen separaten Müll entsorgt. Daraufhin werden wieder 2 ml PBS auf
die Zellen gegeben.
4.4 Kernfärbung mit DAPI zum Apoptose Nachweis:
Petrischalen werden auf der Rückseite mit Parafilm® abgedeckt beschriftet und in eine mit
Alufolie verpackte Schale gegeben. Auf den Parafilm® werden 50- 60 µl DAPI (4′,6-Diamidin-
2-phenylindol) Gebrauchslösung gegeben. Die Gebrauchslösung mit einer Konzentration von
0,2 µg/ ml wurde aus einer Stammlösung mit 200 µg/ ml wie folgt hergestellt.

15
1 µl DAPI Stammlösung (200 µg/ ml) + 999 µl PBS = 1 ml DAPI Gebrauchslösung (0,2 µg/ ml)
Die Herstellung der Gebrauchslösung sowie die folgende Inkubation erfolgten
Lichtgeschützt, da DAPI bei Lichtkontakt schnell ausbleicht. 20 Auf die DAPI Tropfen werden
die gewaschenen Deckgläser mit Zellen so gelegt, das die Zellen in der DAPI Lösung liegen.
Nach 30 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur in der mit Alufolie abgedeckten
Schale werden die Deckgläser wieder in Petrischalen gegeben und einmal mit 2 ml des selbst
hergestellten PBS sowie zweimal mit 2 ml bidest. H2O gewaschen.
Auf beschriftete Objektträger werden zwei Tropfen Glycergel gegeben und darauf die
Deckgläser mit den Zellen so, dass diese im Gel liegen. Dieser Schritt muss zügig geschehen,
da Glycergel bei Raumtemperatur schnell fest wird, deshalb wird die Gelflasche auch in
warmem Wasser gelagert. Durch das Glycergel werden die Zellen eingeschlossen. Die fertig
bedeckten Objektträger werden nun mindestens 2 Stunden im Kühlschrank gelagert, damit
das Glycergels aushärten kann.
4.5 Kontrolle der am Vortag hergestellten Passage 10 im Inversen Mikroskop:
Da sich die Zellen (C 6) im Brutschrank des Labors befinden, werden auch hier vor Entnahme
die Hände gewaschen, Latex-Handschuhe angezogen und mit 70% Ethanol eingesprüht. Die
Zellen werden schnell aber behutsam aus dem Brutschrank genommen um zu gewährleiste,
dass die Temperatur (37° C) und der C02 Gehalt (5 %) nicht zu stark sinken.
Die Zellkonzentration ist gering, da sie erst am Vortag angesetzt wurden, aber keine Flasche
ist kontaminiert. Auch ohne die Beschriftung der Flaschen zu kennen, lässt sich unter dem
Mikroskop erkennen in welche Flaschen 2 und in welche 5 Tropfen Zellsuspension gegeben
wurden, da die Menge an Zellen in den 5 Tropfen-Flaschen deutlich höher liegt.
20 http://www.applichem.com/shop/produktdetail/as/dapi-ibiochemicai/ (2.11.2012)

16
4.6 Auftauen der am Vortag eingefrorenen Zellen:
Es wird wieder im Labor gearbeitet, deswegen müssen vor dem Arbeitsbeginn, die Hände
gründlich gewaschen, Latex-Handschuhe angezogen und mit 70 % Ethanol gesäubert
werden. Beim Auftauen, muss rasch, aber nicht hastig gearbeitet werden um ein Möglichst
gutes Ergebnis zu erhalten und die Zellen wenig Stress auszusetzen. Es wird von jedem
Teilnehmer je ein Kryoröhrchen der am Vortag eingefrorenen Passage 10 (Passage bleibt
gleich nach dem auftauen) im Wasserbad bei 37° C und unter ständigem schwenken
aufgetaut. Davor wird der Arbeitsplatz in der Clean-bench mit Abfallgefäß,
Zentrifugenröhrchen, Zellkulturfläschchen und Pipetus vorbereitet. Die Gefäße werden im
Vorfeld beschriftet um eine Verwechslung auszuschließen, außerdem werden 8 ml
Zellmedium im Zentrifugenröhrchen vorgelegt. Die Zellen werden in der Clean-bench direkt
aus dem Kryoröhrchen in das vorgelegte Medium pipettiert und anschließend bei 200 g, 5
Minuten Zentrifugiert um ein Pellet zu erhalten, es ist darauf zu achten, dass das passende
Gegengewicht gegenüber liegt. Daraufhin werden 4 ml Medium in ein beschriftetes
Zellkulturfläschchen pipettiert, der Überstand abgeschüttet und das Pellet in 1 ml Medium
resuspendiert. Der Milliliter indem, das Pellet gelöst wurde wird komplett zu den
vorgelegten 4 ml Medium pipettiert. Das Zentrifugieren und Resuspendieren in neuem
Medium ist unabdingbar, um das Kryoprotektiva DMSO zu entfernen, da es bei
Raumtemperatur einen osmotischen Stress auf die Zelle auswirkt.
Nach Beendigung der Arbeiten wurden die Geräte verstaut, die Clean-bench mit 70%
Ethanol gereinigt und die Hände vor Verlassen des Labors gewaschen.
4.7 Apoptose Nachweis unter dem Konfokalen-Lasermikroskop:
Die am Vormittag mit DAPI gefärbten und fixierten Zellen werden unter dem Konfokalen-
Lasermikroskop mit einem 100er Objektiv betrachtet um zu sehen, wie sich die
unterschiedlichen Cäsiumchlorid Konzentrationen auf die Zellen ausgewirkt haben und
unterschiedlich Apoptose Stadien festzustellen. DAPI ein Fluoreszenz Farbstoff, der an die
AT-reiche DNA Regionen bindet. wird bei dieser Methode mit einem UV Laser (Einstellung

auf 364 nm in diesem Fall) angeregt und emittiert Licht welches nach dem stokes-shift
Prinzip 21 langwelliger ist. Das emittierte Licht wird von einem Detektor aufgenommen an
17
einen Computer weitergeleitet und ist am angeschlossenen Bildschirm sichtbar (siehe Bild 1,
Kontrolle 01 DW). Im Gesamtbild kann man sehen, welches Volumen der Zellkern einnimmt.
Das Auswertungslabor ist abgedunkelt, da DAPI wie oben beschrieben bei normalem Licht
ausbleicht.
Zellkerne Zellen Überlagerung von Zellen und
Zellkern
Bild 1, Kontrolle 01 DW
4.8 Ergebnisse des Apoptose Nachweis:
Einige Zellen der Kontrollprobe befinden sich schon in einem frühen Apoptose Stadium. Es
können jedoch Zellen gefunden werden die so wie es sein sollte nicht in Apoptose gegangen
sind, diese sind rund, gleichförmig und zeigen eine durchgehend geleichmäßige Kernfärbung
(siehe Bild 2, Kontrolle 02 DW). Auch die Morphologie dieser Zellen ist relativ gleichmäßig.
Die gleichmäßige Färbung bedeutet, dass das Chromatin nicht abgebaut ist.
21 http://www.univie.ac.at/mikroskopie/3_fluoreszenz/definition/2_stoke.htm (31.10.2012)

Bild 2, Kontrolle 02 DW
18
Ähnliche Form, Größe und
gleichmäßige Färbung
Erstaunlicherweise sind im direkten Vergleich bei den Proben die in 15 mM Caesiumchlorid
Lösung eingelegt wurden weniger Zellen in Apoptose, als bei den Kontrollproben. Dies ist
wahrscheinlich das Resultat der relativ kurzen Einwirkzeit von ca. 19 Std. Nichts desto trotz
können Anfangsstadien der Apoptose wie leichte Fragmentierung und abweichende
Morphologie erkannt werden (siehe Bild 3, 15mM CsCl 03 IP).
Abweichende Morphologie
angehende Chromatin
Fragmentierung

Die Zellen, die in 30 mM CsCl Lösung eingelegt sind zeigen schöne fortgeschrittene
19
Apoptose. Die Zellen sind schon geschrumpft, das Chromatin erscheint kondensierter, man
erkennt schwach DNA Fragmente und die Zellen fragmentieren (siehe Bild 4, 30 mM CsCl
PS). Weiter fällt auf, dass keine Zellfortsätze mehr zu erkennen sind und sie eine deutlich
fragmentierte Morphologie aufweisen. Man kann also erkennen, dass die doppelte Menge
an CsCl Lösung erheblich Auswirkungen auf die Zellen hat.
Bild 4, 30 mM CsCl PS
Zellen sind geschrumpft,
weisen starke Lysis auf, das
Chromatin ist fragmentiert
5. Vertieftes Thema: Steriltechnik und Subkultur 22
5.1 Einleitung:
Sterilverfahren werden angewendet, um mögliche Kontaminationen zu verhindern.
Kontaminationen werden durch Bakterien, Mycoplasmen, eukaryotische Pilze, Hefen, Viren
oder Kreuzkontaminationen sowie durch den Kontakt mit anderen Zellen verursacht.
Kontaminationen sind besser (Bakterien, Pilzen) oder schlechter (Viren, Mycoplasmen)
bemerkbar. Steril bedeutet nicht, dass alle Keime von einer Oberfläche entfernt sind,
sondern, dass die vermehrungsfähigen Keime abgetötet bzw. inaktiviert sind, sowie die
Sporen bei bestimmten Arten. Der Begriff Desinfektion, beschränkt sich auf das
Abtöten/Inaktiviren der vermehrungsfähigen Keime, jedoch nicht der Sporen. Das Sprühen
22 Vgl. Sabine Schmitz, Der Experimentator: Zellkultur 3. Auflage, Heidelberg, Kapitel 6

20
von Desinfektionsmittel sollte aus folgenden Gründen vermieden werden, da sich sog.
„Sprühschatten“ bilden, d.h. nicht alle Stellen werden von dem Desinfektionsmittel erreicht
und sobald die Stelle noch Wasser enthält, macht die Verdünnung das Desinfektionsmittel
unbrauchbar. Quellen für Kontaminationen sind: der Experimentator, Keime, die sich in der
Luft befinden, unsterile Glasgefäße, kontaminierte Materialen (Medien, Zellen, Labortiere,
etc.), Straßenschuhe, Fehlen eines Zelllaborkittels. Oft sind Pipetten nicht mehr steril, da
man Arbeitsschritte nicht in der richtigen Reihenfolge durchgeführt werden, z.B. erst die
Pipette aus der Verpackung genommen und dann erst die Flasche des Mediums aufgedreht.
Die Folge ist ungewöhnliche Bewegung während des Arbeitens, dies führt oft dazu, dass die
Pipetten Spitze irgendwo anstößt und diese nicht mehr steril ist. Ebenso sind Tropfen von
Medium eine häufige Ursache, da sie als Nahrungsgrundlage für Zellen fungieren. Deshalb
sollten solche Tropfen sofort mit einen Papiertuch aufgewischt und mit dest. H2O und ETOH
(70%) gesäubert werden. Wichtige Schritte für eine sterile Arbeit sind:
Vor dem Arbeiten: Hände gründlich waschen und Handschuhe tragen
Arbeitsfläche mit Alkohol putzen
Lüftungsöffnungen nicht durch Materialien zu stellen und Geräte vor Gebrach
sterilisieren
Zellen sollten unter einem Mikroskop auf Kontaminationen kontrolliert werden,
bevor sie verwendet werden
Nicht über geöffnete Flaschen und Behälter arbeiten
Neue Materialien verwenden, wenn diese unsteril geworden sind oder nur bei
dem Verdacht
Verschüttete Lösungen sofort mit EtOH (70%) reinigen
Sprechen werden des Arbeitens sollte vermieden werden
Bei Erkrankungen sollte auf das Arbeiten im Labor verzichtet werden oder mit
entsprechenden Schutz gearbeitet werden (Mundschutz, etc.)
5.2 Sterilsationsverfahren
Vor dem eigentlichen Sterilverfahren sollten Geräte und Materialien eine Reinigung
und/oder Desinfektion durchleben. Auch Sterilisationsverfahren sind keine Garantie, dass

21
alle Keime auf einer Oberfläche verschwunden sind. Da die Keimtötung mathematischen
Gesetzen ausgesetzt ist, kann nur die Wahrscheinlichkeit für die Abtötung erhöht werden.
Standardisiert ist die Reduktion um eine sechsfache Logarithmusstufe, d.h. die Keimzahl
muss sich um einen Millionenfaktor verringern. Die Dauer der benötigten Sterilisation ist von
der Vorbelastung des Materials durch Keime abhängig, je höher die Belastung, desto höher
ist die Dauer der Sterilisation. Die Abtötung der Keime unterliegt einer Logarithmusfunktion,
d.h. das in einem bestimmten Zeitraum 90% der Keime abgetötet, dieser ist für jede
Kontaminationsart anders definiert.
5.2.1 Hitzesterilisation
Es gibt zwei Parameter bei diesem Verfahren, der erste ist der sog. „D-Wert“. Dieser Wert
gibt die Dauer bei einer konstanten Temperatur von 121°C an um die Keimanzahl, um einen
Faktor zu verringern. Deshalb wird er auch Dezimal- oder Destruktionswert genannt. Der
Wert kann für jeden Organismus experimentell bestimmt werden, es werden die Anzahl der
lebende Keime gegen die Zeit bei einer Temperatur aufgetragen. So erhält meine
„Abtötungskurve“, diese verläuft exponentiell. Sie hängt von mehreren Faktoren ab: pH-
Wert, Luftanteil in der Probe, Schmutz, etc.
Der zweite Parameter ist die Effektivität oder auch F-Wert genannt, dieser Wert bezeichnet
die benötigte Zeit bei konstanter Temperatur in der alle Keime abgetötet werden. Im
Gegensatz zu dem D-Wert wird hier nicht nur die Ausgangskeimzahl sondern auch die
Überlebenswahrscheinlichkeit berücksichtigt.
Sterilsationsverfahren werden in verschiedene Klassen eingeteilt: feuchte oder trockene
Hitze, Strahlung (UV, ionisierende), Chemikalien (Alkohole, Radikale, etc.) oder Filtration. Die
Wahl der Methode hängt von den Eigenschaften des zu sterilisierenden Materials ab,
Hitzebeständigkeit, Art und Umfang der Kontamination.

5.3 Verfahren mit feuchter Hitze:
5.3.1 Dampfsterilisation:
22
Dieses Verfahren benutzt reinen, gesättigten und mind. 121°C heißen H2O-Dampf, dieser
muss auf alle Oberflächen einwirken (Vorsicht bei Beladung des Geräts, nichts übereinander
stellen), dies geschieht in Autoklaven oder Dampfdrucktöpfen. Unter einem Autoklaven
versteht man Gerät, das Gas dicht abschließt, in ihm wird Wasser unter erhöhten Druck (1-2
bar) und bei konstanter Temperatur zu Dampf erhitzt. Durch den Wasserdampf quellen vor
allem die Sporen der Keime auf, dadurch werden sie weniger resistent, als bei der
Verwendung von trockener Hitze. Nach DIN EN 285 müssen Dampfsterilisationen bei einer
Mindesttemperatur von 121°C und einem Druck von 2 bar und mindestens 15 min lang
durchgeführt werden (ist meist auch der Laborstandard). Ein Schnellverfahren kann auch bei
134°C, 3 bar und mindestens 3 Minuten durchgeführt werden. Das Verfahren eignet sich für
Instrumente und kleinere Flüssigkeitsvolumina, bei größeren Volumina müssen die Zeit für
das Erwärmen der Flüssigkeit, sowie deren Abkühlungszeit berücksichtigt werden. Bei
Krankheitserregern muss die Dauer, Temperatur an arretiert werden und auf eine
funktionierende Abluftfiltration. Des Weiteren sollten folgende Faktoren beachtet werden:
Manche Bakterien können in Sporenbildung umschalten, dies ist eine
Überdauerungsform. Somit kann die Dampfsterilisation unter normalen Bedingungen
fehlschlagen.
Viren besitzen unterschiedliches Genom (DNA oder RNA), Membranhüllen, deshalb
sind die Resistenzen gegenüber Hitze sehr variabel
Pilze sind in der „Normalform“ sehr empfindlich gegenüber Hitze (Zellkern, Zellwand,
etc.), jedoch die Sporenform kann in manchen Fällen jede Sterilisation überleben

23
Krankheitserreger Inaktivierungszeit (in Min) Temperatur (in °C)
Tuberkuloseerreger, pathogene
Streptokokken, Polioviren
Vegetative Bakterien, Hefen,
Schimmelpilze, alle Viren (auch AIDS-
Viren), ausgenommen Hepatitis-Viren
alle vegetative Bakterienarten, alle
Viren, auch Hepatitis A,B und C
Tabelle 1: Inaktivierung von Infektionserregern bei feuchter Hitze (modifiziert nach
Wallhäußer) 23
Der Sterilisationsvorgang wird in 4 Schritte unterteilt:
1. Autoklav erreicht die eingestellte Temperatur (Steigzeit)
2. Das Sterilmaterial erreicht die eingestellte Temperatur (Ausgleichszeit)
3. Gesamter Innenraum wird durch Dampf ersetzt (Sterilisationszeit)
4. Das Sterilmaterial wird durch ein Vakuum getrocknet (Vakuumphase)
30
30
10
62,5
80
98-100
Es sollte nur trockenes Material aus dem Autoklaven entfernt werden. Daneben sollten
Indikatorbänder zur Kontrolle aufgeklebt werden, diese Bänder zeigen eine Farbreaktion
wenn eine bestimmte Temperatur und Druck erreicht ist. Diese Farbreaktion zeigt den
erfolgreichen Sterilisationvorgang an, die sicherste Methode ist ein Bioindikator (B.
stearothermophilus). Eine Kultur wird mit autoklaviert, ist die Kultur abgestorben, so war der
Sterilisationsvorgang erfolgreich. Ergebnis hängt von Faktoren ab:
Ausgangskeimzahl
Art der Keime und deren Eigenschaften
Umgebungsbedingungen (pH-Wert, Membranhüllen, etc.)
Dampfsättigung
Temperatur
Behandlungszeit
23 Aus Sabine Schmitz, Der Experimentator: Zellkultur 3. Auflage, Heidelberg 2011 S.93

Überladen oder falsches Bestücken
Mangelnde Dampfqualität (nicht kondensierbare Gase, Überhitzung)
24
Undichte Ventile, Schläuche, Dichtungen
Flaschen nicht verschließen
Zwei Verfahren können unterschieden werden, Vakuumsverfahren (Mehrfach wird die Luft
abgepumpt (Evakuieren) im Wechsel mit Bedampfungsphasen) und Strömungs- oder
Gravitationsverfahren (Luft wird durch gesättigten H2O-Dampf ersetzt).
5.4 Verfahren mit trockener Hitze:
Luft leitet Hitze schlechter als Wasserdampf, daraus resultieren längere Sterilisationszeiten
und höhere Temperaturen. Daher ist dieses Verfahren für hitzestabile Materialen
(Glaswaren, Metallinstrumente, etc.) besonders geeignet.
5.4.1 Heißluftsterilisation:
Dieses Verfahren wird in Sterilisationsschränken ohne Luftzufuhr durchgeführt. Je nach
Eigenschaften des Sterilmaterials (Wandstärke, Material, etc.) müssen die Zeiten durch
Rechnungen ermittelt werden, z.B. übereinander gestapelte Petrischalen erreichen erst nach
ca. 3,5 h die gewünschte Temperatur von 160°C. Angemessene Zeiten sind: 3 h bei 150°C, 2
h bei 160°C und 30 min bei 180°C (diese Zeit wird im Labor am meisten verwendet). Oft
werden die Zeiten zu kurz gewählt oder die Eigenschaften des Materials falsch eingeschätzt,
dies führt zu einer unvollständigen Sterilisation und somit wird das Material für die
Verwendung in einem Zellkulturlabor unbrauchbar. Deshalb sollten die Zeiten für die
Sterilisation lieber etwas großzügiger angenommen werden.

5.4.2 Abflammen oder Flambieren:
Diese Methode dient der Reduktion von Keimen an der Oberfläche von Materialen. Die
nötige Voraussetzung ist, dass die Oberfläche lang genug durch die Flamme eines
Bunsenbrenners gezogen bzw. gehalten wird. In der Flamme eines Bunsenbrenners
(moderne Version „Fire Boy“) herrschen Temperaturen von ca. 500-1000°C. Bei einer
Temperatur von 100°C lässt sich zwar schon eine Keimreduktion feststellen, diese betrifft
25
aber nur die vegetative Form. Durch die Flamme ziehen wird nur bei Glasgegenständen noch
praktiziert, sind die Gegenstände jedoch aus Metall, werden diese vorher in 70% EtOh
eingetaucht und der Alkohol mit einer Flamme entzündet. Danach die Möglichkeit einer
Verpufferung oder unter einer Clean-bench mit Umluftzirkulation Explosionsgefahr besteht,
sollte dieser Vorgang sehr sorgfältig und mit Verstand durchgeführt werden. Generell ist zu
dieser Methode zu sagen, dass sie wenig effizient in Bezug auf deren Gefahren ist, werden
die Materialen nicht ausreichend abgekühlt, könnte eine hyperthermische Behandlung der
Zellen die Folge sein, was zur Folge hätte, dass die Zellkultur mit hoher wahrscheinlich
absterben wird.
5.4.3 Ausglühen:
In der Mikrobiologe eine weit verbreitete Methode, glühfeste Metalle werden vor und nach
dem Gebrauch durch die Flamme eines Bunsenbrenners oder Elektrodenbrenners mit
Keramikröhre gezogen. Vor allem Impfösen werden mit dieser Methode behandelt, bei
pathogenem Material wird zusätzlich unter einer Glocke ausgeglüht.
5.5 Sterilifiltration:
Hier werden Flüssigkeiten und Lösung mittels einer Spritze durch eine Membran
(Porengröße von 20 μm) gespritzt, alle Keime, Verunreinigungen, die größer als die
Porengröße sind bleiben an der Membran hängen (Konzentrat). Somit wird eine sterile
Lösung erreicht (Filtrat). Die Membran besteht üblicherweise aus Zellulose, diese Methode

dient für die Sterilisation von hitzeempfindlichen Lösungen (Vitamin-, Mediums-,
Proteinlösungen, etc.). Ein Beispiel ist: Endotoxine von gramnegativen Bakterien, diese
Liposaccharide sind hitzestabil und überstehen jede Sterilisation mit Hitze. Deshalb bietet
sich hier eine Sterilifiltration an.
5.6 Sterilisation durch Strahlung:
Die Sterilisation erfolgt durch Gammastrahlen oder durch UV-Licht und ist vor allem bei
26
Kunststoffgefäßen oder sehr proteinreichen Lösungen (lassen sich schwer filtrieren, da die
Membran schnell verstopft) geeignet.
Das benötigte UV-Licht wird mit einer Wellenlänge von ca. 254 nm (UV-C), von einem Hg-
Dampf emittiert. Solche Lampen werden je nach Verwendung schon in die Werkbänke
eingebaut. Für die Effektivität solcher Lampen sollten drei Grundvoraussetzungen erfüllt
sein:
regelmäßiges Austauschen der Lampen am besten sollte dies jährlich geschehen, da
die Leistung mit dem Alter der Lampe kontinuierlich sinkt. Die Lampe sollte auch
nicht die ganze Nacht in Betrieb sein.
Der Abstand von Lampe zu Sterilgut sollte 30 cm nicht überschreiten (Ideal zwischen
10-30cm). Die Strahlen werden mit anwachsendem Abstand immer schwächer, da sie
den optischen Gesetzen unterliegen. Die Desinfektionswirkung unterliegt dem
Dosisprinzip (Zeit x Strahlenleistung), die jeweilige benötigte Zeit kann je nach
Organismus Mikrosekunden-Sekunden betragen.
Strahlen müssen die gesamte Oberfläche erreichen, Spitzen, -ständer oder –kästen
werden so nicht sterilisiert, da die Strahlen nicht das gesamte Material erreichen.
Der Umgang mit UV-Licht sollte sehr umsichtig sein, Materialen und der Experimentator
selber erleiden unter Umständen mehr Schäden als die Sterilisationswirkung wirklich von
Nutzen ist. UV-Licht macht z.B. Plastik mit der Zeit spröde, beim Menschen kann eine
kanzerogene Wirkung die Folge sein.

5.7 Mediumwechsel und Subkultur
5.7.1 Mediumwechsel
Das Medium dient als Lebensgrundlage der Zellen, da es sich durch den Zellstoffwechsel langsam
verbraucht oder die Abfallprodukte das Medium ansäuern (Mediumfarbe wechselt zu gelblichen
27
Ton), muss es in regelmäßigen Abständen gewechselt werden.
Manche Zelllinien benötigen noch Reste des alten Mediums für Wohlerkennen, dies beruht auf die
Konditionierung des Mediums, d.h. Zellen geben nach einiger Zeit Wachstumsfaktoren (Insulin-,
epidermale- oder transformierende Wachstumsfaktoren), Cytokine (CSF, G-CSF) oder auch Interferon
in das Medium ab. Diese Bestandteile sind für eine stabile Zellkultur wichtig, deshalb sollte bei
adhärenten Zellen ein Teil des alten Mediums steril filtriert werden und mit dem neuem Medium
angesetzt werden. Frei-flotierende Zellen, saugen sich mit dem alten Medium voll, somit kann das
alte Medium komplett ersetzt werden.
5.7.2 Mediumwechsel bei adhärenten Zellen:
Der Mediumwechsel erfolgt durch Absaugen des alten Mediums (z.B. Pasteurpipette und
HVK) ohne dass der Zellrasen beschädigt wird. Danach wird an der überliegen Seite des
Zellrasens das neue Medium mit einer Pipette in die Zellkulturfalsche pipettiert.
Anschließend wird die Falsche gedreht und halbverschlossenen in den Brutschrank gestellt.
5.7.3 Mediumwechel bei Suspensionszellen:
Hier wird einfach neues Medium zu dem alten gegeben (Subkultivierung), dies hat eine
Volumenzunahme in der Zellkulturfalsche. Alternativ kann man die Zellen sedimentieren
lassen und vorsichtig etwas altes Medium aus der Zellkulturfalsche absaugen und
anschließend neues Medium hinzufügen.

5.7.4 Subkultur:
Dieser Vorgang wird auch Passagieren genannt, dies dient der Reduzierung der Zelldichte.
Werden Zellen zu dicht so erfolgt eine Kontaktinhibitation und die Zellen wachsen nicht
28
mehr. Deshalb sollten die bevor sie eine 90% Konfluenz (Maß für die Zelldichte) aufweisen
passagiert/gesplittet werden.
5.7.5 Subkultur von adhärenten Zellen:
Zuerst wird das Medium abgesaugt und danach muss der Zellrasen enzymatisch von der
Zellkulturfalsche abgelöst werden. Dies geschieht mit einer Lösung von Trypsin/EDTA (im
Wasserbad erwärmt auf 37°C -> höhere enzymatische Aktivität). Sollte sich der Zellrasen
unter der Einwirkung von der Trypsinlösung nicht richtig ablösen (Kontrolle Unter einem
Mikroskop oder Zellkulturfalsche gegen das Licht halten), kann durch vorsichtiges Klopfen
auf die Unterseite der Zellkulturfalsche ein mechanischer Reiz ausgelöst werden. Danach
werden zwei neue Zellkulturfalschen mit Medium angesetzt und die Zellen auf beide
Zellkulturfalschen aufgeteilt. Die Enzymreaktion von Trypsin stoppt unter der Zugabe von
neuem Medium. Das Zählen der Zellen erfolgt wie im oben beschrieben Versuch des
Protokolls! Für Zellen, die sich in der Mitosephase befinden, wird das sog. „mitotic-shake-off-
Verfahren“ verwendet. Dadurch werden alle Zellen die in der Mitose befinden
synchronisiert. Damit spielt diese Vorgehensweise vor allem in der Genetik für
Zellzyklusuntersuchungen eine Rolle. Adhärente Zellen können auch mit einem
Gummischaber abgelöst werden, dass empfiehlt sich nur bei starkanheftenden Zellen oder
Tumorzellen, da die auftretenden Scherkräfte die Zellen mechanisch schädigen würden.
5.7.6 Subkultur von Suspensionszellen:
Bei diesen Zellen kann auf enzymatische Ablösung verzichtet werden, da sie schon frei im
Medium flotieren. Zellen müssen jedoch vor dem Splitten ausreichend suspendiert werden,
die Zellen kleben sehr leicht zusammen. In der Regel wird einfach ein Teil alten Mediums mit

den Zellen abgesaugt und durch das gleiche Volumina des neuen Mediums ersetzt. Das
29
absaugte/pipettierte wird in eine neue Zellkulturfalsche gegeben und auch mit dem gleichen
Volumina an neuen Medium aufgefüllt. Das Verhältnis des Ausdünnens der Zellen ist von
Zellen zu Zellen unterschiedlich, daher sollte auf Literatur zurückgegriffen werden. Sollte aus
Experimentellen Gründen eine Zellzählung von Nöten sein, werden die Zellen wie oben im
Protokoll zentrifugiert und in der Neubauerzählkammer ausgezählt.
6. Verwendete Medien, Lösungen und Chemikalien:
Gibco, F-10 Nut Mix (Ham)(1x), 500ml
Poly-D-Lysine hydrobromide (10ml Auqa bidest. = 1%) von 29.10.2012
500 mM CsCl Stammlösung (von Kursleiterin hergestellt)
Na2HPO4: Sigma Chemical Co. , MW = 142 g/ mol
NaCl: Sigma Chemical Co. , MW = 58,44 g/ mol, 99% Reinheit
K2HPO4: Riedel-de-Haën, MW = 136,1 g/mol, 98-100 % Reinheit
Trypan blue Solution (0,04%): Sigma, prepared in 0,81 % Sodium chloride and 0,06%
Potassium phosphate; dibasic (100ml)
Methanol: Carl-Roth GmbH 99,9 % P.A. ; MW: 32,04
Eisessig: Carl-Roth GmbH 100% P.A; MW : 60,05
Dimethyl-Sulphoxide (DMSO): Sigma, Hybri.MAX® Exp. 06/2014
Bidest. Bzw. Millipore Wasser
4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI Stammlösung 200 µg/ ml)
7. Geräte und Materialien:
Zentrifuge
Brutschrank (37°C, 5 % CO2)
Clean-bench/ Lamina-flow
Abzug
Pipetus Pipettierhilfe

Pipetten 1 µl- 1000 µl
Pasteurpipetten
Pipettenspitzen 2 µl- 50 µl
pH-Meter
Wage
Spatel
Wäge Schälchen
30
Gläser und Becher in verschiedenen Ausführungen
Zentrifugenröhrchen
Mikroreaktionsgefäße
Kryoröhrchen
Kühlschrank
Gefriertruhe
Wasserbad
Objektträger und Deckgläser (12 mm Durchmesser)
Pinzetten
Inverses- Mikroskop
Konfokales-Lasermikroskop
Magnetrührer
Parafilm®
Zellkulturfläschchen
Petrischalen (36 mm Durchmesser)
Feuchtekammer (in Alufolie eingepackt)
Bechergläser
8. Literatur:
http://www.univie.ac.at/mikroskopie/3_fluoreszenz/definition/2_stoke.htm
(31.10.2012)
Sabine Schmitz, Der Experimentator: Zellkultur 3. Auflage, Heidelberg 2011 S. 93,
206, 218

31
http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Product_Information_Sheet
/d5879pis.Par.0001.File.tmp/d5879pis.pdf
https://de.vwr.com/app/catalog/Product?article_number=734-0146 ( 1.11.2012)
Skript Oberascher & Handlechner, 2012 S. 2
http://www.invitrogen.com/1/3/pbs-buffer (2.11.2012)
http://www.applichem.com/shop/produktdetail/as/dapi-ibiochemicai/ (2.11.2012)
http://www.applichem.com/de/shop/produktdetail/as/trypanblau-ci-23850/
(3.11.2012)