Molekulare Ökologie - BayCEER

Molekulare Ökologie der Insekten SS 2012
Module: MSc Molekulare Ökologie der Insekten / Experimentelle
Insektenbiologie
Vorlesung Molekulare Ökologie der Insekten (2st)
SS 2012
Klaus H. Hoffmann
Tierökologie I
Molekulare Ökologie Hoffmann SS 2012
1

16.04.2012 Vorbesprechung
19.04.2012 Übersicht Molekulare Ökologie: vom Makromolekül zu niedermolekularen
Strukturen (Anwendung in Populationsgenetik und Biodiversität)
26.04.2012 Anpassungen an biotischen und abiotische Stress (Beispiel Populationsdichte
und Schwermetalle)
03.05.2012 Biotischer Stress: Abwehrmechanismen und Insektenimmunologie
10.05.2012 Wirt-Parasitoidbeziehungen und Polydnaviren
24.05.2012 Pflanzen-Herbivoren-Interaktionen: Induzierte Pflanzenabwehr
und Glukosinolate
31.05.2012 Molekulare Analyse der Ernährung und Verdauung und der Insektendarm als
„target“ in der molekularen Schädlingsbekämpfung
14.06.2012 Regulation der Pheromonbiosynthese und olfaktorische Rezeptoren
(Geruchsinn der Insekten)
21.06.2012 Hormon- und Vitellogenin/Lipoprotein-Rezeptoren (Insekten und Zecken)
28.06.2012 Molekulare Grundlagen der Seidenproduktion bei Arthropoden
05.07.2012 Die molekularen Grundlagen der Inneren Uhr der Insekten
12.07.2012 Insektenbiotechnologie
19.07.2012 Klausur
Molekulare Ökologie Hoffmann SS 2012 2

Literatur:
Baker A.J.: Molecular Methods in Ecology, Blackwell Science, Oxford (2000)
Freeland, J.R.: Molecular Ecology, John Wiley & Sons, Chichester (2005)
Beebee T., Rowe G.: An Introduction to Molecular Ecology, Oxford
University Press, Oxford (2008)
Howe H.F., Westley L.C.: Anpassung und Ausbeutung, Spektrum,
Heidelberg (1993)
Schierwater B., Streit B., Wagner G.P., DeSalle R.: Molecular ecology and
evolution: approaches and applications. Experientia Suppl. 69 (1994)
Seybold S.J.: The eight days of discovery: molecular biology comes to
chemical ecology. J. Chem. Ecol. 30 (2004)
Tittiger C.: Functional genomics and insect chemical ecology. J. Chem. Ecol.
30 (2004)
Townsend C.R., Begon M., Harper J.L.: Ökologie, Springer-Heidelberg (2009)
Molekulare Ökologie Hoffmann SS 2012 3

www.bio.mq.edu.au
Molekulare Ökologie: vom Makromolekül zu
niedermolekularen Strukturen
Molekulare Genetik in der Ökologie
Molekulare Marker in der Ökologie
Populationsgenetik
Erhaltungsgenetik (conservation genetics; Artenschutz)
Phylogeografie, Evolution
Molekulare Grundlagen der Verhaltensökologie
Mikrobielle Ökologie
Molekulare Identifikation: Arten, Individuen und Geschlecht
Molekulare Anpassungen (Biochemische und Physiologische
Ökologie; Genetische Ökotoxikologie)
Molekulare Grundlagen der Chemischen Ökologie
(Trophische Wechselbeziehungen)
Genmodifizierte Organismen (GMOs), Gentransfer
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012
1

Molekulare Ökologie
• Aspekte der Ökologie, die sich mit molekularen/-genetischen Grundlagen
ökologischer Strukturen und Prozesse beschäftigen
• Ökologische Analysen auf der Ebene von Molekülen (Makromoleküle und
niedermolekulare Verbindungen)
• Methoden im engeren Sinne: randomly amplified polymorphic DNA (RAPD),
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), DNA-Sequenzierung,
Mikrosatelliten-Analyse, DNA-Sonden, gezieltes Ausschalten von Genen
(RNA-Interferenz, Mutationen), cDNA- und genomische Datenbanken
• genetische Zusammensetzung einer Population, Genfluss zwischen
Populationen, Artdifferenzierung und Verwandtschaftsanalysen, Artenzusammensetzung
von Mikroorganismen, ökologische Genetik, molekulare
Phylogenetik, Evolutionsökologie
• Biochemische, Physiologische und Chemische Ökologie
• molekulare Mechanismen von intra- und interspezifischer Kommunikation
• Wechselbeziehungen Organismen / Umwelt auf molekularer Ebene
• Modellorganismen und postgenomische Ära
Aedes Anopheles Apis Bombyx Drosophila Tribolium
http://de.wikipedia.org/wiki/Liste_sequenzierter_Organismen
Nasonia
Acyrthosiphon
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 2

Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 3

Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 4

huizen.ddsw.nl/bewoners/pieterw/bicyclus.jpg
Genotyp vs. Phänotyp
Aus: Freeland, Molecular
Ecology, Wiley
hu.wikipedia.org
Kohlschabe Plutella cylostella
Bicyclus anynana: ein Genotyp tritt
umweltbedingt in zwei verschiedenen
Phänotypen auf = phänotypische Plastizität
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 5

Aus:
Townsend/Begon/
Harper: Ökologie,
Springer, 2009
Molekulare Differenzierung innerhalb von Arten
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 6

Genetische Marker- Bestimmung von Verwandtschaftsbeziehungen
Aus: Freeland, Molecular
Ecology, Wiley
• nukleäre DNA (biparental)
• mitochondriale DNA (Mutter)
• haploide Chromosomen
(paternal oder maternal)
Geschlechtsbestimmung
Bei Säugern: XX, XY
Bei Lepidoptera, Vögel: ZW, ZZ
homozygot/hemizygot
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 7

• nicht alle Marker gleich gut geeignet (Abhängigkeit von Fragestellung)
• unterschiedliche genetische Variabilität
• unterschiedlich schnelle Evolution
• co-dominante Marker ermöglichen Identifikation aller Allele (Ausprägung eines Gens)
an einem Locus (bestimmten Ort)
• dominante Marker offenbaren nur ein dominantes Allel, aber einfacher zu handhaben
Co-dominante Marker dominante Marker
____________________________________________________________________
Allozyme (Proteine) RAPD (random amplified polymorphic DNA)
RFLPs (restriction fragment length polymorphism) AFLPs (amplified fragment length polymorphism)
Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) (auch mit unbekannten Sequenzen)
Micro-/Minisatelliten (DNA Fingerprinting;
Sequenzen müssen bekannt sein)
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 8

Holger Schulz, Institut für
Umweltwissenschaften, Universität
Koblenz-Landau
Proteine
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 9

Proteine Co-dominante Marker
Weniger Anwendungsmöglichkeiten für Proteine als DNA:
• Zeigen weniger Polymorphismen
• Benötigen mehr Ausgangsmaterial
• Werden in Raum (gewebespezifisch) und Zeit (entwicklungsspezifisch)
unterschiedlich expremiert
• Sind schwierig im nicht-denaturierten Zustand zu erhalten
• Aber kostengünstig
Anwendungen zur Identifikation:
⇒ Allozym Analyse: Trennung alleler Varianten mit unterschiedlicher
elektrophoretischer Mobilität, aber vom selben Locus codiert
⇒ Monoklonale Antikörper: Sondierung spezifischer Proteine
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 10

Enzyme: monomer bis tetramer
Holger Schulz, Institut für Umweltwissenschaften, Universität Koblenz-Landau
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 11

Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, abgekürzt RFLP (sprich: "Riflip",
von engl.: Restriction Fragment Length Polymorphism) bezeichnet Unterschiede
von DNA-Sequenzen homologer Chromosomen, welche als verschiedene
Restriktionsfragmentmuster (z. B. bei der Gelelektrophorese) sichtbar werden.
Die Länge eines Restriktionsfragments wird durch Mutation beeinflusst, bei der
eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym entsteht oder verloren geht.
Mit Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP, engl. Single Nucleotide
Polymorphism; sprich: Snip) werden Variationen von einzelnen Basenpaaren in
einem DNA-Strang bezeichnet. Die Definition, dass SNPs bei mindestens 1 %
der jeweiligen Population vorkommen müssen, ist nach der Einführung neuester
molekulargenetischer Methoden in der Praxis nicht mehr relevant.
SNPs stellen ca. 90 % aller genetischen Varianten im menschlichen Genom dar.
Als AFLP (Abk. für engl. amplified fragment-length polymorphism) wird eine
Technik bezeichnet, mit der ein Genetischen Fingerabdruck erstellt werden kann.
Bei der AFLP wird die DNA durch zwei Restriktionsenzyme in Fragmente
zerschnitten. Danach werden mit Hilfe zweier Polymerase-Kettenreaktionen
einige Fragmente vervielfältigt (amplifiziert). Durch Unterschiede in der Anzahl der
Restriktions-Schnittstellen entstehen verschieden lange Fragmente, deren Muster
auf einem Elektrophorese-Gel zur Unterscheidung von Individuen und auch zur
Darstellung naher Verwandtschaften genutzt werden kann.
Nach: Wikipedia
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 12

DNA: Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP)
Co-dominante Marker
Aus: Horton/Moran/Scrimgeour/Perry/Rawn, Biochemie, 4. Auflg.,
Pearson, München
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 13

DNA Co-dominante Marker
PCR-basierte Anwendungen: Microsatelliten -> genetisches Fingerprinting
⇒ Variationen in Microsatelliten (nicht-codierende, kurze, repetitive DNA
Sequenzen; STRs) entstehen meist durch fehlerhafte Strangpaarung
(slippage) bei der DNA Replikation. Mikrosatelliten können zur
Genanalyse verwendet werden, da die Anzahl der Wiederholungen sich
bei verschiedenen Individuen unterscheidet und deswegen bei der
enzymatischen Spaltung mit einem Restriktionsenzym DNA-Fragmente
unterschiedlicher Länge hervorbringt. Auf diese Weise können
Polymorphismen in der DNA festgestellt werden
Karine Van Doninck
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 14

Microsatelliten
⇒ Microsatelliten können mittels PCR amplifiziert werden, unter
Verwendung von Templaten für die angrenzenden Regionen
(spezifische Primer)
⇒ Ein häufiges Beispiel für einen Microsatelliten ist eine (CA)n
Wiederholung, wobei n zwischen den Allelen variabel ist
Karine Van Doninck
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 15

Auswertung der Daten
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 16

DNA (random amplified polymorphic DNA) dominante Marker
PCR basierte Anwendungen: RAPD –> genetisches Fingerprinting
Zufällig vervielfältigte polymorphe genomische DNA unter Verwendung kurzer (8-12
Nukleotide) Zufallsprimer. Einsatz bei Untersuchungen zu phylogenetischer Verwandschaft
von Pflanzen und Tieren ohne Sequenzierungen.
Primer
5'-A-C-C-G-T-3'
Amplifizierte DNA
5'-A-C-C-G-T-G-G-G-T-C-A-A-C-T-G-G-C-G-C-A-C-C-G-T-A-A-T-T-G-G-C-A-3'
3'-T-G-G-C-A-C-C-C-A-G-T-T-G-A-C-C-G-C-G-T-G-G-C-A-T-T-A-A-C-C-G-T-5'
Primersequenz, Komplementärsequenz
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 17

Lepidoptera,
Kartoffelschädling
www.pherobase.com
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 18

Sequenzanalysen: Mitochondriale DNA
2 rRNA genes
Homo sapiens
Anopheles gambiae Insect Mol. Biol. 2, 103-124, 1993
Locusta migratoria J. Mol. Evol. 41, 928-941, 1995
Apis mellifera Genetics 133, 97-117, 1993
6 Proteine
7 tRNAs
URF = unidentified
reading frame
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 19

Auswertung der Daten
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 20

Arthropodenphylogenie mittels mtDNA
Aus: Boore et al., Nature 376, 163, 1995
Bestätigung der Monophylie der Arthropoden und der Mandibulata (Insecta,
Crustacea und „Myriapoda“). Keine Bestätigung für die Uniramia (Insecta,
„Myriapoda“ und Onychophora)
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 21

Molekulare Identifikation von Individuen
Identifikation von Krankheitsüberträgern (Vektoren)
⇒ Unterscheidung von Arten in einem kryptischen
Artenkomplex
⇒ Beispiel: Anopheles
⇒ Anopheles maculipennis (Europäischer Malaria Vector)
⇒ Anopheles gambiae (Afrikanischer Malaria Vector)
⇒ Anopheles culicifacies (Indischer Malaria Vector)
⇒ Komplex von morphologisch sehr ähnlichen Arten, die
nicht alle als Krankheitsträger auftreten
⇒ Einige Arten resistenter gegen Insektizide als andere
⇒ Identifikation über Polymorphismen hinsichtlich Sequenz
und/oder Größe von Fragmenten (z.B. ITS2 internal
transcribed spacers) unter Verwendung von
artspezifischen Primern
Karine Van Doninck
Anopheles gambiae
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 22

Beispiel aus der ökologischen Praxis
Aus: Townsend/Begon/Harper: Ökologie, Springer, 2009
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 23

Functional Genomics - Experimente
Aus: Tittiger, J. Chem. Ecol. 30, 2335, 2004
EST = expressed sequence tags
(transkribierte Nukleotidsequenzen einer Zelle,
erfasst werden die gerade exprimierten Gene eines
Gewebes)
MICROARRAY = Genchip
liefert Information über Aktivität vieler einzelner Gene
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 24

Unter RNA-Interferenz (RNAi, auch RNA-
Silencing) versteht man einen natürlichen
Mechanismus in eukaryotischen Zellen, der die
Genexpression einzelner Gene hemmt.
RNA Interferenz - RNAi
abdominal
injizierte dsRNA
(ds) Lösung
siRNA – Duplex
„small interfering“
21-23 nt
siRNA-Protein Komplex
Bindung an komplementäre mRNA
Abbau der mRNA
keine Expression z.B.
eines Peptids/Proteins
Molekulare Ökologie (1) Hoffmann SS 2012 25

Spezifische Anpassungen an biotischen und
abiotischen Stress
(Populationsdichte und Schwermetalle)
www.biologie.uniosnabrueck.de/Oekologie
Dichtestress, Übergang von solitärer zur gregärer Phase bei
Wüstenheuschrecken, Signale bei Nymphen und Imagines, chemische
Signale, mechanische Signale
Stress und natürliche Selektion in Boden-Ökosystemen
Stressfaktoren: Hitze und Kälte, Trockenheit, hohe Salinität, Anoxie, toxische
Komponenten wie Schwermetalle
Genomische Antworten auf Stressfaktoren: Signalwege und
Transkriptionsfaktoren
Adaptation an Stressfaktoren (Stresstoleranz)
Metallothioneine (Phytochelatine)
Aquatische Insekten und Biomonitoring
Orchesella cincta, Collembola
insektenfotos.de
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012
1

Antworten von Pflanzen und Tieren auf Umweltstress
• Organismen am Rande ihrer ökologischen Nischen
• Mechanismen innerer Homöostase
• oft gleiche biochemische (molekulare) Antwort auf unterschiedliche Stressfaktoren
(z.B. heat shock proteins)
• Molekulare Ökologie untersucht (nicht nur) genomische Antworten auf Stress
Aus: Roelofs et al., Funct. Ecol. 22,8-19, 2008
Zwischen Pflanzen und Bodenarthropoden
ähnliche Antworten auf Genebene, aber sehr
unterschiedliche auf Ebene der
Transkriptionsfaktoren. Bei biotischem Stress
oft Hormone als Signaltransduktoren
eingeschaltet.
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 2

Wüstenheuschrecken - Eine wahrhaft biblische Plage
Geschätzter Schaden durch einen Heuschreckenschwarm
Der Schwarm bedeckt eine Fläche von 1040 km 2 ~ 10 3 km 2
40-80 Million Heuschrecken/km 2 ~ 5 . 10 7 Heuschrecken/km 2
Das sind 10 3 x 5 . 10 7 ~ 5 . 10 10 Heuschrecken im Schwarm
Eine Heuschrecke wiegt ~ 2 g, und frißt ihr eigenes Gewicht pro Tag
Der Schwarm frißt 2 x 5 x 10 10 g = 10 11 g = 10 8 kg = 10 5 t
= 100,000 Tonnen Vegetation pro Tag!
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 3

Wie kommt es zur Schwarmbildung?
Phasen der Wanderheuschrecken
Solitäre Phase (isoliert)
Transiente Phase (Übergangsphase)
Gregäre Phase (aggregiert)
Phasen(di)polymorphismus =
Phasenpolyphenismus = kontinuierlicher
Übergang, der von der Dichte der
Population abhängt
Schistocerca gregaria
Photograph courtesy Compton Tucker,
NASA GSFC
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 4

Charakteristika des Phasendimorphismus
• Solitäre Tiere sind durch Tarnfärbung vor Räubern geschützt
• Solitärphase = höheres Fortpflanzungspotential -> erhöhtes
Populationswachstum
• Bei zu hoher Populationsdichte ziehen Tiere in Gebiete mit
Niederschlag und guter Vegetation
• Übergang von Solitär- zu Gregärphase über mehrere Generationen
• Gregärphase = Wanderphase -> Schwarmbildung zur Wanderung in
neue Nahrungsgebiete (hohes Flugvermögen)
• Tiere paaren sich und legen wieder Eier
• Bei „Dürre“ gehört neue Generation wieder zur Solitärphase
Verhaltensänderungen innerhalb weniger Stunden
Physiologische Veränderungen (z.B. Hormone Juvenilhormon und Corazonin, Stoffwechsel)
in nächster Generation
Morphologische und ökologische Veränderungen nach mehreren Generationen
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 5

Signale, die eine Aggregation auslösen
• Unterschiedliche Signale bei Nymphen und Imagines
• Olfaktorische Signale (leichtflüchtige Substanzen), insbesondere
aus den Fäzes
• Chemische Kontaktsignale (Kontaktpheromone) aus dem
Integument (Kutikula)
• Mechanische Signale durch Kontaktstimulation
• Visuelle Stimuli (meist nur ergänzend wirksam)
• Chemische Signale aus dem Schaum um die Eipakete (wirken
bereits auf schlüpfende Erstlarven)
• Akustische Signale scheinen keine Rolle zu spielen
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 6

Olfaktorische Signale aus den Fäzes von Nymphen
Flüchtige aromatische Substanzen z.B. aus den Fäzes
Lösen meist zusammen mit optischen Signalen bei isolierten Nymphen
gregäres Verhalten aus (Aggregationspheromone)
Nach H.-J.
Ferenz, Halle
* Wird von Bakterien im Darm produziert
** Wurde nur in adulten Tieren sicher nachgewiesen
*** Erst 1999 entdeckt
Die Wirksamkeit von Locustol ist sehr zweifelhaft
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 7

Aggregationspheromone bei adulten Tieren
Relativer Beitrag der Körperteile eines gregären adulten, geschlechtsreifen
Männchens von S. gregaria an der Emission von Phenylacetonitril und Veratrol
(nach Seidelmann et al., 2003, J. Insect Physiol. 49: 1125-1133). Die Bildung
von Phenylacetonitril erfolgt hauptsächlich in den Flügeln und Beinen.
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 8

Mechanische Kontaktstimuli an Nymphen des letzten Stadiums
Induktion von gregärem Verhalten durch mechanischen Kontakt an
verschiedenen Körperteilen. Berührung der Oberfläche des Oberschenkels
(Femur) am hinteren Beinpaar löst signifikante Verhaltensänderungen aus
(Simpson et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 3895-3897).
Berührung an den Antennen führt bei adulten Weibchen zur Produktion
gregärer Nachkommen (Maeno et al., 2010)
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 9

Neue Ergebnisse aus Science 323, 627, 2009:
Die Konzentration des „Glückshormons“ Seretonin ist in der
gregären Phase in der Hämolymphe dreifach erhöht.
Seretoninhemmer verhindern den Übergang zur gregären Phase.
Berührungsreize tragen zu dieser Erhöhung bei, aber auch
„Sehen“ und „Riechen“ des Artgenossen.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 3259, 2012:
Solitäre und gregäre Tiere unterscheiden sich im Stoffwechselprofil der
Hämolymphe (HPLC, GC), insbesondere des Fettstoffwechsels. Die
Konzentration an Carnitin (ß-Oxidation der Fettsäuren) steigt parallel zum
Übergang von solitär zu gregär (RNA-interferenz, Injektionsversuche)
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 10

Verschiedene abiotische Stressfaktoren
• Hitzestress: Induktion von Hitzeschockproteinen (Hsp), generell eingesetzt
bei kurzfristiger Stressabwehr (Schock), Hsp 27, Hsp 40, Hsp 60 (Chaperone),
Hsp 70/ Hsp 90
Die Grafik zeigt die scherenartige Bewegung des
Hitzeschockproteins Hsp90 in der offenen und der
geschlossenen Form (Hintergrund). Die
Arbeitsweise des Proteins haben 2008 zwei
Gruppen der TUM aufgeklärt. (Bild: TUM)
• Hitzeakklimatisation: langfristige Produktion von Hsp, gesteuert durch heat
shock Transkriptionsfaktor HSF und hypoxia (!) Transkriptionsfaktor HIF-1;
Aktivierung weiterer Signalweg, insulin-like signalling pathway
(Lebensdauer), Katalase und Superoxid-Dismutase (oxidative Stressabwehr)
• Kälte: Gefriertoleranz (Superkühlung, thermische Hysterese, Toleranz
extrazellulären Gefrierens = Gefrierresistenz, Dehydrierung); Gefriervermeidung
• Trockenheit und hohe Salinität: Kryptobiose, Anhydrobiose; Verhinderung
von Membranschäden (erhöhte Glycerin- und Trehalose-Biosynthese,
Chaperone, Faktoren der Kälteanpassung)
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 11

Aus: Spektrum der Wissenschaften,
5/2009, 42
Aufgaben der Hitzeschockproteine
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 12

Schwermetalle: Lokalisation in saprophagen Arthropoden
• Die Schwermetalle: Pb, Cu, Cd, Zn, As, Co, Hg, Ni, Fe, [Ca]
• Saprophage Bodenarthropoden: Isopoda (Asseln), Diplopoda (Hundertfüssler),
Collembola (Springschwänze)
www.gardensafari.net
photo.net
Porcellio scaber Glomeris marginata
insektenfotos.de
Orchesella cincta
• Isopoda: intrazelluläre Akkumulation in Speicherzellen (B- und S-Zellen) des
Hepatopankreas (Granulae). Abgabe über Kutikula mit der Häutung.
Aus: Köhler, Micr. Res.
Tech. 56, 393, 2002
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 13

• Diplopoda: Speicherung von Cd und Pb in Granulae von Zellen des
resorptiven Mitteldarmepithels, Zn in der Kutikula
Aus: Köhler, Micr. Res.
Tech. 56, 393, 2002
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 14

• Collembolen: intrazelluläre Speicherung in Granulae von Mitteldarmzellen,
Abgabe mit gesamten Darmepithel während der Häutung (hohe Toleranz),
z.T. Speicherung in äußerer Mitochondrienmembran (Zn)
Aus: Köhler, Micr. Res.
Tech. 56, 393, 2002
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 15

Adaptation an Schwermetallbelastung
Adaptation im Laufe einiger Generationen (Labor) bzw. Jahrzehnte (Freiland) schließt
genetische Variationen in der Schwermetalltoleranz, Metallverstoffwechselung,
Exkretion, Immobilisation, kompartimentalisierte Speicherung und Veränderung in der
Lebenszyklusstrategie (kürzere Lebenszeit, verstärktes Wachstum, höhere
Reproduktion) ein:
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 16

toxisch wenig toxisch
Exkretionsleistung
Aus: Posthuma and Van Straalen, Comp.
Biochem. Physiol. 106 C, 11-38, 1993
Schwermetalle sind oft schon in geringen Konzentrationen giftig, einige werden
aber in geringeren Konzentrationen als essentielle Elemente (Cu, Zn z.B. für
Cofaktoren in Enzymen) benötigt.
Voraussetzung für Adaptation: genetische Variation !
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 17

Aus. Janssens et al., Insect Science 16, 3-18, 2009
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 18

Molekulare Mechanismen der Schwermetalltoleranz:
Metallothioneine (MT, Mtn)
• genetisch stark polymorphe Proteine, oft in Parenchymgewebe
(Darm, Leber, Niere, Bauchspeicheldrüse, Hepatopankreas)
• geringes Molekulargewicht, cytoplasmatisch, Cystein-reich (30%), frei
von aromatischen Aminosäuren, Metallbindungsproteine
• erster Nachweis 1957 als Cd-bindendes Protein in der Pferdeniere
• Klasse I MT in Vertebraten mit 20 hochkonservierten Cys-Resten
6000-7000 Da, 60-68 AS, Bindung von 7 bivalenten Metallionen
• Klasse II MT in Pflanzen, Pilzen und Invertebraten
• Klasse III MT = Phytochelatine der Pflanzen
www.bioc.uzh.ch/mtpage/MT.html
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 19

Molekulargenetik: polymorph mit vielen Unterfamilien, Untergruppen, Isoformen:
www.bioc.uzh.ch/mtpage/MT.html
5‘UTR enthält regulatorische Elemente, u.a. eine oder mehrere Kopien
eines MRE (metal responsive element), das als Bindungsstelle für den
Transkriptionsfaktor MTF-1 (metal transcription factor-1) fungiert,
der die MT-Genexpression reguliert.
UTR = untranslatierter Randbereich der mRNA
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 20

Metallothioneine der Invertebraten
Aus: Dallinger, Comp.
Biochem. Physiol.
113C, 125, 1996
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 21

Regulation der Genexpression von Mtn bei Cd-Belastung
• bisherige Untersuchungen ausschließlich an Drosophila
• Janssens et al. (2009) an Orchesella cincta
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012
22

Aus. Janssens et al., Insect Science 16, 3-18, 2009
Glutathion = antioxidatives Peptid
• Regulation von MT über MTF-1 und
MRE (5‘UTR) bisher nur bei
Drosophila nachgewiesen
• Eine Vielzahl von anderen
Promotoren (Transkriptionsfaktoren)
und Signalwegen bei Orchesella
cincta, Porcellio scaber, Limnodrilus
hoffmeisterii, Chironomus reparius
involviert
• Bei O. cincta 49 Gene nach Cd-
Belastung über- oder unterexprimiert
(SSH, suppression subtractive
hybridization analysis)
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 23

Allgemeine Stress-Faktoren Signalwege
Aus: Roelofs et al., Functional Ecology 22, 8-18, 2008
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 24

Nature Reviews Cancer 9, 537-549 (2009)
TK-Rezeptor
Mitogene = Proteine, die Zellteilung
anregen
Kinasen = Proteine die Phosphatgruppen
übertragen (Phosphorylierung)
Aktivierung der MAP-Kinasen
Mitogen
↓
MAP-KK Kinase (MAP3K)
↓
MAP-K Kinase (MAP2K)
↓
MAP Kinase (MAPK)
↓
weitere Signalwege
Film
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 25

Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 26

Aquatische Invertebraten als Indikatoren für Wasserqualität
„Biomonitoring“
• artunterschiedliche Toleranzen gegenüber Schwermetallen
• Akkumulation von Schwermetallen proportional zur Konzentration im Wasser
• Konzentration im Wasser oft unter Detektionsgrenze, im Tier darüber (bis
100-fach)
• Verbleib im Organismus bei annähernd konstanter Konzentration bis zu 15
Monate
• Eintagsfliegen (Ephemeroptera) und Steinfliegen (Plecoptera) sehr geeignet für
Cu, Pb, Ag und Zn. Eintagsfliegen toleranter gegenüber Sauerstoffmangel
• Analyse mittels AAS (Atom Absorption Spectroscopy)
• Bei Chironomus Induktion von MT durch Schwermetallexposition
zoology.fns.uniba.sk www.samford.edu
www.cartage.org.lb
Molekulare Ökologie (2) Hoffmann SS 2012 27

Abwehrmechanismen und Insektenimmunologie
Abwehr von Krankheitserregern, Parasitoiden, Fremdkörpern
Allgemeine Abwehrmechanismen
Vergleich Immunsystem Wirbeltiere-Säugetiere und Insekten
Körperepithele als Abwehrbarriere
Natürliches/angeborenes (innate) vs. erworbenes (adaptive)
Immunsystem
Humorale und zelluläre Abwehrreaktionen
Melanisierung und Koagulation in der Hämolymphe
Synthese antimikrobieller Peptide im Fettkörper
Phagocytose durch Hämocyten, Einkapselung (encapsulation)
Spezifität des Immunsystems der Insekten
Molekulare Grundlagen der Immunität (Gene für antimikrobielle
Peptide, Signalwege)
RNA-Interferenz und antivirale Immunität
Wirkung entomopathogener Pilze
Einsatz antimikrobieller Peptide in der Schädlingsbekämpfung
www.bienenwabe.de
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012
1

Passive Abwehr: Primäre Abwehrmechanismen
1. Verhaltensweisen zum Schutz vor Feinden (z.B. Verstecken)
2. Tarnung (Mimese), Aposematismus und Mimikri
Aktive Abwehr: Sekundäre Abwehrmechanismen
1. Totstellreflex (Thanatose), Flucht/Fallen lassen, Kampf/Angriff
2. mechanische, chemische, optische und akustische Abwehr
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 2

Innere Abwehr
Abwehr von Bakterien, Viren, Pilzen, Parasitoiden
usw. durch Erkennungsmoleküle,
zelluläre und humorale Abwehr
Immunität ?
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 3

Das Immunsystem der Wirbeltiere im Vergleich
zu den Insekten
Aus: Heldmaier/Neuweiler, Vergleichende
Physiologie 2, Springer, Berlin
Lymphatisches Organ an der Kloake
Insekten zeigen ebenfalls
zelluläre und humorale
Immunreaktionen,
besitzen aber „kein“
adaptives Immunsystem.
Dennoch findet man z.B.
bei Drosophila viele
Gene, die homolog zu
jenen im adaptiven
Immunsystem der
Säugetiere sind.
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 4

Zelluläre Abwehrreaktionen bei Insekten
Infektionswege:
• Chitinkutikula i.d. R. eine wirksame Barriere
• mit der Nahrung aufgenommene Pathogene (Bakterien, Protozoen)
• Verwundungen (Picken Vögel, Stich Schlupfwespe)
• Wundreaktionen: Koagulation der Hämolymphe, Wanderung von Hämocyten,
Melaninablagerungen (Wundverschluß)
• Koagulation: lösliche Hämolymphfaktoren (Lipophorine, Lektine-
Glykoproteine) + Hämocyten
Aus: Gellespie et al., Annu. Rev. Entomol. 42, 611-643, 1997
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 5

Hämocyten
5 Klassen von Hämocyten, die aus kleinen, cytoplasmaarmen Prohämocyten
(Stammzellen) entstehen:
• Plasmatocyten mit großem Kern und wenigen Einschlüssen im Cytoplasma
• Granuläre Zellen mit kleinem Kern und zahlreichen Einschlüssen
• Oenocytoide mit Peroxidase und Phenoloxidase (Melanisierung)
• Spherulocyten mit sauern Mukopolysacchariden
• Cystocyten
Aus: Trenczek, Biol. in uns. Zeit. 22(4), 212, 1992
Aus. Dettner/Peters, Lehrbuch der Entomologie, Spektrum, Heidelberg
Prohämocyte in
Teilung
Oenocytoid
Spherulocyt
Granulocyt
Plasmatocyt
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 6

Aus: Gellespie et al., Annu. Rev. Entomol.
42, 611-643, 1997
Hämocyten und zelluläre Antworten
Netzwerk
Aggregat (Nodulus)
Phagocytose
Rezeptorvermittelte Endocytose
Einkapselung (Kapside)
zellulär: Lepidoptera
melatonic (humoral): Diptera
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 7

Melanisierung
Aus: Trenczek, Biol. in uns. Zeit.
22(4), 212, 1992
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 8

Aus: Müller / Frings, Tier- und
Humanphysiologie, Springer,
Heidelberg, 2009
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 9

Toll-Signalweg
Induktion der Melanisierung (Signalweg)
PPO, Prophenoloxidase; PPO-AE, PPO-aktivierender Faktor; Spn27A, Serinprotease-Inhibitor;
DIF, dorsal related immune factor; Spz, Spätzle
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 10

www.christophfrank.de/Eva
/rezeptorenimmunsystem.pdf
Der Toll - Signalweg
Toll-like Rezptoren sind Membranrezeptoren des angeborenen Immunsystems zur
Erkennung von Substanzen aus Mikroben. Name nach toll- Gen aus Drosophila
(Dorsoventralachse in der Embryonalentwicklung). IL1 = Interleukin-1, nF-kB =
Transkriptionsfaktor im Kern.
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 11

Induktion humoraler Abwehrfaktoren
• Phenoloxidase (s.o)
• Lektine (Agglutinine) zur Verklebung von Bakterien
• Hämolysine (lytische Proteine). Wirkung von Lysozym auf Gram-positive
Bakterien
• induzierbare antimikrobiell wirksame Proteine / Peptide (Boman, 1972).
Meist kationische Peptide gegen Gram-positive oder Gram-negative
Bakterien = „Defensine“
• antifungale Peptide und Proteine
Aus: Trenczek, Biol. in uns. Zeit. 22(4), 212, 1992
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 12
bung)

Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 13

Strukturen antimikrobieller Peptide
Peters et al. PLoS
Pathogens 6 (10)
e 1001067 (2010)
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 14

Drosophila
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 15

Anionisches Bombyx mori
defensin-like peptide
Aus: Wen et al., Molec. Biol.
Reports 36(4), 711-716, 2009
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 16

ß-Actin
Entwicklungsstadien
Aus: Wen et al., Molec. Biol.
Reports 36(4), 711-716, 2009
Entgiftung in Malphighigefäßen
Basale Expressionsraten
Bombyx mori Defensin
Durch E. coli induzierte
Expressionsraten
Zeitverlauf der induzierten
Expression
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 17

Aus: Altincicek/Vilcinskas,
Insect Biochem. Molec. Biol.
37, 726-731, 2007
Evolution der Insekten-Defensine
Thermobia domestica,
ein Vertreter der
Aperygota (Thysanura)
www.tolweb.org
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 18

Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 19

Kontrolle der Expression von antimikrobiellen
Peptiden (AMP) nach
Kontakt mit Gram-positiven Bakterien
und Pilzen (Toll-Signalweg) und Gramnegativen
Bakterien (Imd-Signalweg;
immune deficiency)
PGRP, Peptidoglykane der Bakterien
Spaetzle, 12 kDa Protein das an Toll bindet
Cactus, wird phosphoryliert
DIF, dorsal related immunity factor
DREDD, Drosophila Caspase-8 homolog
TAK1, TGF-ß aktivierte Kinase
IKK, IkB-Kinasen
Relish, wird phosphoryliert
JNK, Aktivierung von Cytoskelettproteinen
durch eine c-Jun N-terminale Kinase
Aus: Hoffmann, Nature 426, 33-38, 2003
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 20

Wirkungsweise antimikrobieller Peptide
Peters et al. PLoS
Pathogens 6 (10)
e 1001067 (2010)
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 21

Antivirale Immunität
RNA-Interferenzmechanismus bei Arten mit systemischer Reaktion (z.B. Tribolium
castaneum), nicht aber Drosophila (nur lokale Wirkung).
Ein neu entdeckter Weg der dsRNA Aufnahme bei adulten D. melanogaster ist
essentiell für virale Abwehr (Saleh et al., Nature 458, 346-350, 2009)
Upon viral infection, virus-specific dsRNAs
(for example, replication intermediates) are
generated during the initial rounds of virus
replication. After cell death or lysis,
dsRNAs are taken up and processed by
uninfected cells to protect them from
subsequent infection, thereby preventing
virus spread.
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 22

Bangham et al., Immunity
25, 1-5, 2006
Zusammenfassung
Jak, Janus-Kinase Hopscotch fördert Transkription antiviraler Gene;
STAT = Signal Transducers and Activators of Transcription
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 23

Einsatz von antimikrobiellen Peptiden in der Schädlingsbekämpfung
Expression tierischer antimikrobieller Peptide in Kulturpflanzen,
z.B. Tabak -> transgene Pflanzen -> Schutz vor Mehltau-Pilz
J Pest Sci (2005) 78: 187–191
Ersatz für Antibiotika bei multiresistenten Bakterien ???
Molekulare Ökologie (3) Hoffmann SS 2012 24

Wirt-Parasitoidbeziehungen / Polydna-Viren (PDV)
Parasitoide (ihren Wirt tötend): Hymenoptera, Diptera
Idiobionten und Koinobionten
Braconiden und Ichneumoniden (Hymenoptera)
Immunsuppression: Venomsekret, Calyxdrüsenzellen,
Calyxsekret, Bracoviren, Ichnoviren, Nucleocapside,
Virionen und dsDNA, Integration in das Parasitoidengenom,
PDV-Genexpression, PDV-Proteine, Teratocyten,
molekulare Mimikry, vertikale Transmission
Konformer – Regulator: Nährstoffversorgung, Analblase,
endokrine Dysfunktion, Entwicklungshormone
(Juvenilhormone und Ecdysteroide, Neuropeptide),
Entwicklungsstillstand
Anwendungen in der biologischen Schädlingsbekämpfung
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012
1

Parasitoide- halb Parasit, halb Räuber
• Hymenoptera, Ichneumonoidea (Schlupfwespen), Ichneumonidae
(Schlupfwespen i.e.S.; solitär), Braconidae (Brackwespen; solitär oder gregär)
• idiobiontische Ektoparasitoide (A) (basale Entwicklungsstrategie, geringe
Wirtsspezifität, Wirt paralysiert, Parasitierung stoppt Wirtsentwicklung)
• koinobiontische Ektoparasiten (B) (Wirt setzt Entwicklung fort)
• koinobiontische Endoparasiten (hohe Wirtsspezifität, Wirt nur teilweise
paralysiert und entwickelt sich weiter, solitäre und gregäre Entwicklung)
• idiobiontische Endoparasiten (C) (parasitieren sessile Wirtsstadien z.B. Ei und
Puppe; einige wenige Ichneumonidae)
• Wirte: Lepidoptera, Coleoptera, Homoptera, Diptera
A
www.ars.usda.gov www.ces.ncsu.edu
Habrobracon hebetor
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 2
B
Euplectrus sp.
Trichogramma sp.
C

Endoparasitische Koinobionten
Aphidius ervi (Braconidae) attackiert
eine Erbsenblattlaus ,
Acyrthosiphon pisum
Glyptapanteles liparidis Weibchen
(Braconidae) beim Anstich einer
Schwammspinner-Raupe, Lymantria
dispar
Aus: Schopf, Biol. in uns. Zeit 37 (5), 290-298, 2007
alexwild.smugmug.com
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 3

Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 4

Ektoparasitoide und Gifte (venom)
• niedermolekulare und hochmolekulare (hexamerine) Gifte mit
paralysierender (lähmender) Wirkung (Peptide, Proteine)
• Wirkungsdosis 1: 200 Mill. Teile Hämolymphe
• entwicklungshemmende Stoffe (Häutungshemmer, Apolysis, Ecdysis)
Endoparasitoide: PDVs, Gifte und Teratocyten
• immunsuppressive Moleküle (zelluläre und humorale Abwehrreaktionen)
• endokrine Dysfunktion (Manipulation der Entwicklungshormonspiegel im
Wirt); Entwicklungshemmung
• Umstellungen in der Biochemie und Physiologie (Ernährung) des Wirtes
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 5

Polydnaviren: Vorkommen, Herkunft und Funktion
• in zwei Familien: 5 von 23 Unterfamilen von Braconidae (Brackwespen) und
2 von 23 Unterfamilien der Ichneumonidae (Schlupfwespen)
• Abzweigung der Unterfamilien vor ca. 100 mya
• Lebenszyklus: parasitoide Wespe, PDVs, lepidoptere Wirtslarve
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 6

Herkunft der Viren: (a) aus dem Wespengenom; (b) aus Virenstammformen
siehe Vorlesung 6
Ichnoviren zeigen (Sequenz)ähnlichkeiten zu Ascoviren
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 7

Polydnaviren (PDVs)
• Bracoviren zylindrisch mit konstantem Durchmesser aber variabler Länge
• Ichnoviren linsenförmig mit polydispersen, circulären dsDNA Molekülen
• Ein oder mehrere Nucleocapside (mit dsDNA-Ringen) pro Virion
• Produktion im Calyxgewebe des endoparasitischen Weibchens, nahe
lateralem Ovidukt
• Freisetzung durch Zelllysis (Bracovirus) oder Membranknospung
(Ichnovirus)
• Injektion der Virenpartikel und div. Proteine in der Calyxflüssigkeit mit Ei/Eier in
die Hämolymphe des Wirts
• In der Wespe Viren-Replikation mit DNA-Replikation. Viren-DNA ist Teil des
Wespengenoms
• Vertikale Weitergabe an alle Wespennachkommen
• Polydna-Genom 75 bis 250 kbp
• keine Replikation der Viren-DNA im Wirt, aber Expression z.B. im Fettkörper
Aus: Schmidt, Biol. in uns.
Zeit 21 (5), 255, 1991 www.healthcare.uiowa.edu/
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 8

Aus: Glatz et al., Trends Microbiol. 12 (12), 245-
424, 2004
www.biocontrol.ento.vt.edu
Cotesia rubecula (Braconidae)
an Pieris rapae Larven
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 9

Aus: Glatz et al., Trends Microbiol.
12 (12), 245-424, 2004
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 10

Polydnavirus-vermittelte Änderungen in der Wirts-Immunität –
zelluläre Immunität
Molekulare Ökologie (4)
Hoffmann SS 2012
Aus: Glatz et al., Trends Microbiol. 12 (12), 245-424, 2004
Unterstützung durch 29 – 34 kDa Calyxproteine auf der Eioberfläche
11

Polydnavirus-vermittelte Änderungen in der Wirts-Immunität –
humorale Immunität
• reduzierte larvale Plasmamelanisierung
• reduzierte Phenoloxidase (PO)-Aktivität
• reduzierte Aktivitäten von Dihydroxyphenylalanin-Decarboxylase und
Dopachrom-Tautomerase, Enzyme der Eumelaninbildung
• Reduktion in der Aktivität antimikrobieller Peptide (Cecropin, Lysozyme)
Aus: Schopf, Biol. in uns. Zeit
37 (5), 290-298, 2007
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 12

Übersicht zur
systemischen
Immunsuppression
durch Ichnovirus-
und Bracovirus-
Gene
Teilweise molekulare
Mimikry, d.h. mit
VLPs (virus-like
particles)
beschichtete
Eioberfläche,
Ähnlichkeit der
Partikelschicht mit
Wirtsproteinen
Aus: Glatz et al., Trends
Microbiol. 12 (12), 245-424, 2004
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 13

Cotesia rubecula
Rolle von Giftdrüsenproteinen
• Peptide von 1-10 kDa, Proteine bis 100 kDa
• Isoelektrischer Punkt 5-6 (saure Proteine)
• immunologische Kreuzreaktionen mit PDVs oder
Calyxproteinen (gemeinsame Epitope)
• z.T. synergistische Effekte mit PDV-Proteinen
• Wirkungen auf zelluläre und humorale Immunität
• typische lysosomale Proteine (z.B. Metalloproteasen)
Aus: Asgari, Arch. Insect Biochem.
Physiol. 61, 146-156, 2006
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 14

Aus: Asgari, Arch. Insect Biochem.
Physiol. 61, 146-156, 2006
Hemmung der
Melanisierung
Das Giftdrüsenprotein
Vn50 ist ein
Serinprotease-
Homologes wie SPH,
wird aber nicht in zwei
Domänen gespalten;
Serpine wirken als
Serin-Protease-
Inhibitoren
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 15

Rolle der Teratocyten
• Oft polyploide Riesenzellen, keine Zellteilung, ca. 1500 Zellen pro Raupe
• Beteiligung an Hemmung des Immunsystems des Wirtes
• fungistatische Wirkung
• Rolle bei Ernährung und Entwicklung der Parasitoidenlarve im Wirt durch Sekretion (z.B.
ein 540 kDa Protein ähnlich Vitellogenin) und Absorption bestimmter Stoffe
Aus: Schopf, Biol. in uns. Zeit 37 (5), 290-298, 2007
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 16

Entwicklung der Parasitoidenlarve - endoparasitischer Koinobiont
Aus: Schopf, Biol. in
uns. Zeit 37 (5), 290-
298, 2007
• Schonung des Wirtes durch verzögertes
Wachstum in L1 -> geringer Nährstoffentzug
• deutliches Wachstum nach ca. 10 Tagen in L2
(vom Konformer zum Regulator), Bildung der
Analblase
• Analblase zunächst Nährstoff resorbierendes
Organ, dann sekretorische Funktion -> 27
kDa Protein, induziert vorzeitige Häutung
der Wirtsraupe (Ecdysonproduktion) zum
leichteren Schlupf des Parasitoiden
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 17

Steuerung der Wirtsraupenentwicklung
• Manipulation des Juvenilhormon (JH) Titers des Wirtes
• Manipulation des Ecdysteroidtiters des Wirtes (Hemmung der PTTH- Freisetzung,
Degeneration der Prothoraxdrüsen, Hemmung des Ecdysteroidstoffwechsels) ->
Verhinderung der Wirtsmetamorphose
• Akkumulation von Neuropeptiden Allatotropin, Allatostatin, Diuretisches Hormon,
Eclosionshormon (-> Einsatz in der Schädlingskontrolle)
JH III in der Wirtshämolymphe
stammt ausschließlich von
Parasitoidenlarven L2.
Substanzen aus dem PDV-
Venom-Komplex hemmen aber
auch JH-Esteraseaktivität
Aus: Schopf, Biol. in uns. Zeit 37
(5), 290-298, 2007
Molekulare Ökologie (4) Hoffmann SS 2012 18

Pflanzen-Herbivoren-Interaktionen –
Herbivoren-induzierte Pflanzenabwehr
Glucosinolate: Lock- und Abwehrstoffe
Induzierbare Verteidigungsmechanismen bei Tieren und Pflanzen
Direkte Verteidigung (z.B. Dornen, Pflanzentoxine)
Indirekte Verteidigung: „Talking trees“ , Alarmstoffe zur Anlockung von Räubern und
Parasitoiden des Fraßfeindes
Direkte Pflanzenabwehr durch Eiablage, Bildung von Neoplasmen, Bildung von
nekrotischem Gewebe, Produktion von Eiablage-Hemmstoffen
Indirekte Pflanzenabwehr, Anlockung von Eiparasitoiden durch Synomome
wasserlösliche (intraspezifische) und flüchtige (interspezifische) Signalstoffe
Elicitoren, Signalkaskaden, Phytohormone (Jasmonsäure, Ethylen)
Pflanzliche Duftstoffklassen (Terpene, Acetogenine, Aromaten)
Bottom-up und top-down Kontrolle über die Herbivorenpopulation
Expression verteidigungsrelevanter Gene, Up- und Downregulation
Glucosinolate= Senfölglykoside, Kreuzblütler = Cruciferae/Brassicaceae,
aliphatisch, aromatisch, indolisch; Myrosinase
Glucosinolatbiosynthese aus Aminosäuren, Glucosinolatstoffwechsel, Molekulare
Steuerung von Biosynthese und Abbau, Generalisten vs. Spezialisten
Max-Planck-Institut für chemische Ökologie/Vogel
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012
1

www.biologie.uni-hamburg.de
picasaweb.google.com
www.genres.de
Aus: Kuhlmann, Biol. in uns. Zeit 29, 292, 1999
www.bonsai-info.net
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 2

Intraspezifische wasserlösliche Signalstoffe interspezifische flüchtige Alarmstoffe
Aus: Kuhlmann, Biol. in uns. Zeit 29, 292, 1999
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 3

?
Aus: Schulze et al., Chem. in
uns. Zeit 40, 366, 2006
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 4

Signalkaskaden
Fettsäureelicitor
www.habitas.org.uk
H2O2 = ROS
(reactive oxygen
species)
cis-JA = cis-
Jasmonsäure
LOX = Lipoxygenase
Aus: Schulze et al.,
Chem. in uns. Zeit
40, 366, 2006
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 5

Spezifität der Induktion
Aus: Schulze et al.,
Chem. in uns. Zeit
40, 366, 2006
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 6

Durch Eiablage induzierte direkte Pflanzenabwehr
Pisum pisorum
Bruchus pisorum (Bruchidae, Samenkäfer)
agspsrv34.agric.wa.gov.au
Aus: Hilker und Meiners, J. Chem. Ecol. 32, 1379-1397, 2006
Neoplasmen: verstärkte mitotische
Aktivität in Blattzellen, Aktivierung von Np
(neoplastic pod allel), Gewebewucherung
(siehe Gallen), Eier fallen zu Boden
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 7

Hypersensitive Antwort: rasche Bildung von nekrotischem Gewebe nach Eiablage,
Auslöser keine Mikroorganismen sondern Stoffe aus Eizement, hochspezifischer
bisher unbekannter Mechanismus
www.floralimages.co.uk
Solanum sp. und
Leptinotarsa
decemlineata
Produktion von Eiablage-Hemmstoffen: Verhinderung von Oviposition an Stellen mit
bereits abgelegten Eiern, Deterrent z.B. trans-2-[3-(3,4,5-Trihydroxyphenylpropenoyl)amino]-3,5
Dihydroxybenzoesäure aus der Pflanze, mit systemischer Wirkung
www.bio-gaertner.de
Kohlpflanzen und
Pieris brassicae
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012
8

Indirekte Abwehr –
tritrophische Beziehungen Roland Schröder
Molekulare Ökologie (5)
(6)
Aus: Hilker und Meiners,
Entomol. Exp. Appl. 104,
181-192, 2002
Erzwespe
www.ctahr.hawaii.edu
Jack Kelly Clark
Pflanzenwespe
Hoffmann SS 2012 9

Das tritrophische System Ulme – Ulmenblattkäfer – Erzwespe
(Parasitoid)
Ulmus minor
nach Meiners und Hilker,
Berlin, 2000
Xanthogaleruca luteola
(Coleoptera, Chrysomelidae)
Oomyzus gallerucae
(Hymenoptera, Eulophidae)
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 10

Mechanismen der indirekten Abwehr nach Oviposition
• Wundsetzung durch das eiablegende Weibchen (Beseitigung der äußersten Blattschichten)
• Dabei werden keine Duftstoffe freigesetzt
• Synomonfreisetzung nach Oviposition. Elicitor stammt von Eioberfläche und wirkt auf
Parenchymgewebe des Blattes
• Elicitor stammt aus oviductus communis; Chemie unbekannt (Protein, Jasmonsäure?).
Jasmonsäure kommt in hohen Konzentrationen in Insekteneiern vor.
• Mechanismen für systemisch induzierte Pflanzenantworten weitgehend unbekannt
(Aktivierung des Terpenoidsysntheseweges, ß-Farnesenproduktion)
• Wohl weitgehende Parallelen zu Reaktionen nach Fraßschäden
Aus: Hilker und Meiners, J. Chem. Ecol. 32, 1379-1397, 2006
Molekulare Ökologie (6) (5) Hoffmann SS 2012 11

Vergleich der Mechanismen nach Oviposition und Fraß
Aus: Hilker und Meiners,
Entomol. Exp. Appl. 104,
181-192, 2002
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 12

Aus: Schulze et al., Chem. in uns. Zeit 40, 366, 2006
Die pflanzlichen Duftstoffklassen
Entstehung eines komplexen Duftmusters mit einem Minimum an enzymatischer Ausstattung;
qualitative und quantitative Veränderungen im Bouquet ja nach Fraßfeind; tageszeitabhängige
Variationen im Duftmuster (Tabakpflanze nachts gegen Motteneiablage, tags gegen Herbivore)
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012
13

Expression verteidigungsrelevanter Gene
Empoasca sp. (Homoptera) ist eigentlich kein Schädling des
wilden Tabaks (Nicotiana attenuata). Allerdings ernährt und
reproduziert er sich erfolgreich auf gentechnisch veränderten
Tabakpflanzen, in denen eine bestimmte Lipoxygenase (LOX3)
herunterreguliert wurde. Dieses Schlüsselenzym wird von der
Pflanze benötigt, um Signale zu produzieren, die ihre
Verteidigungsreaktionen auslösen.
Aus: Schulze et al., Chem. in uns. Zeit 40, 366, 2006
www.ice.mpg.de
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 14

Zeitverlauf und Spezifität der Aktivierungsmechanismen
Reg = Behandlung mit Regurgitat von M. sexta
W = mechanische Wundsetzung
Aus: Maffei et al., Trends in Plant Sci. 12, 310, 2007
Vm = Plasmamembranpotential
Aus: Baldwin et al., Curr. Opin. Plant Biol. 4, 351, 2001
Nicotiana attenuata
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 15

Spezifische Änderungen in der Genexpression
Reg, Regurgitat; W, mechanische Wundsetzung;
Control, ohne Behandlung
TD, Threonindeaminase – Typ I Expressionsmuster:
Wundsetzung erhöht Expression, Regurgitat wirkt
antagonistisch
PIOX, Pathogeninduzierte Peroxidase – Typ IIa:
Wundsetzung erhöht Expression, Regurgitat wirkt
verstärkend
LHB C1, light harvesting complex subunit C1 – Typ IIb:
Wundsetzung und Regurgitat hemmen Genexpression
Aus: Baldwin et al., Curr. Opin. Plant Biol. 4, 351, 2001
Bei Arabidopsis wurden bis zu 700 mRNA Antworten (Microarray) gefunden; bei Nicotiana
attenuata ca. 500 und bei Tetranicus urticae (Milbe) an Phaseolus lunatus (Limabohne) ca.
100 mRNA Expressionsänderungen. Die meisten Genfunktionen sind allerdings unbekannt.
Oft aber Downregulation photosynthestischer und Wachstums-assoziierter Gene,
Upregulation Abwehr-assoziierter Gene (Signalwege, Duftstoffe und Abwehrsubstanzen).
Aber: Herbivore adaptieren an Abwehrstrategien (z.B. durch Detoxifikation mittels
Cytochrom P-450 Monooxygenasen)
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 16

Direkte und indirekte Antwort der Pflanze auf Herbivorie
Genaktivierung von
Proteaseinhibitoren und
Polyphenoloxidase
(Pflanzentoxine)
Aus: Ferry et al., Curr. Opin.
Biotechnol. 15, 155-161, 2004
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 17

Direkte Wirkungen der Abwehrmechanismen auf Herbivore
Polyphenoloxidasen
Proteinaseinhibitoren
z.B. SBTI
Aus: Chen M.-S., Insect Science, 15,
101-114, 2008
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 18

Aus: Schmidt et al., Molec. Ecol. 13, 981-995, 2004
Expression von S. nigrum Genen nach
Attacke durch den Flohkäfer Epitrix
pubescens, durch Microarray-Analysen
Abwehrsubstanz Trypsin-Proteinase-Inhibitor:
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 19

Glucosinolate: Senfölglycoside der Brassicaceae oder Cruciferae
Aus: Textor and
Gershenzon, Phytochem.
Rev. 8, 149-170
Allgemeine Strukturformel der
Senfölglycoside (Glucosinolate)
Als Zucker tritt immer Glucose auf; das Spaltungsenzym der Glucosinolate ist die Myrosinase
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 20

Glucosinolate: Senfölglycoside der Brassicaceae oder Cruciferae
Aus: Renwick, Entomol. Exp.
Appl. 104, 35-42, 2002
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 21

Biosynthese aus Aminosäuren
• Indolische Glucosinolate aus der aromatischen Aminosäure Tryptophan
• Aliphatische Glucosinolate aus Alanin, Methionin oder einer verzweigten Aminosäure
• Aromatische Glucosinolate aus den aromatischen Aminosäuren Phenylalanin oder Tyrosin
Aus: Textor and
Gershenzon, Phytochem.
Rev. 8, 149-170
Jasmonsäure und Methyljasmonsäure
aktivieren nach
Herbivorie zahlreiche Gene des
Biosyntheseweges. Aber auch
andere Signalwege werden
aktiviert: Ethylen, Salicylsäure
(Pflanzen- und Herbivorenspezifisch).
Up-Regulation z.B. der Gene
CYP79 und CYP83 (Oxidationsschritte)
= Neusynthese
Regulation durch Transkriptionsfaktoren
HIG1/MYB51. HIG1 =
high indolic glucosinolate 1
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 22

Aus: Gigolashvili et al., Plant J. 50, 886-901, 2007
Die Expression erfolgt Gewebe-spezifisch und
schon im Hypocotyl 3-Tage alter Setzlinge.
Überexpression reduziert Insektenfraß durch
einen Generalisten, Spodoptera exigua.
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 23

Insekten-induzierte Veränderungen in der Synthese von Glucosinolaten
• Fraßpflanze Arabidopsis thaliana Columbia WT
• Generalisten Myzus persicae und Spodoptera exigua
• Spezialisten Brevicoryne brassicae und Pieris rapae
www.rothamsted.ac.uk
de.wikipedia.org
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 24
genomebiology.com
www.commanster.eu

Verstoffwechselung von Glucosinolaten durch die Myrosinase
• Bei Blattverletzungen werden aus der Vakuole freigesetzte Glucosinolate durch die
Myrosinase (ß-Thioglucoside-Glucohydrolase) aus den Myrosinzellen zu Glucose und
instabilen Agluconaten hydrolysiert. Nach Elemination der Sulfatgruppe entstehen z.B.
Isothiocyanate (1)/Nitrile (2)/Thiocyanate (3). Die meisten Abbauprodukte haben biocidale
(antimikrobielle) Aktivität.
Aus: Grubb and Abel, TRENDS Plant Sci. 11, 89-100, 2006
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 25

Glucosinolatstoffwechsel in verschiedenen Insektenarten
Generalist
Honigtau
Kot
= Nitril
Spezialist
Kot
Spezialist
Aus: Müller, Phytochem Rev. 8, 121-134, 2009
Molekulare Ökologie (5) Hoffmann SS 2012 26

Molekulare Analyse der Ernährung und Verdauung -
Der Insektendarm als „target“ in der molekularen
Schädlingsbekämpfung
Morphologie des Insektendarms
Molekulare Struktur der peritrophen Membran
Molekulare Identifizierung der Nahrung
Die peritrophe Membran als Barriere gegenüber Allelochemikalien aus der Nahrung
Molekulare Antworten im Mitteldarm auf Allelochemikalien aus der Nahrung
Anpassungen bei blutsaugenden Arthropoden gegenüber Häm-Toxine
Proteintransport über die Darmwand der Arthropoden, Transportmechanismen
Proteinabbau im Mitteldarm durch spezifische Proteinase
Bakterien im Verdauungstrakt der Insekten
Mechanismen der Celluloseverdauung z.B. bei Termiten
Bakterien in den Mycetocyten von Blattläusen (essentielle Aminosäuren)
Angriffspunkte für biologische Kontrollagentien
Insektenpathogene (z.B. Bacillus thuringiensis), Viren (NPV und GV)
Rekombinante Baculovirensysteme
Insektenspezifische Peptidhormone, die nicht in Bakterien / Baculovirussystemen
exprimiert werden können (TMOF)
Pflanzliche Proteaseinhibitoren
www.apsnet.org
RNA-Interferenz vermittelter Pflanzenschutz (dsRNA im Futter)
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012
1

Molekulare Struktur der peritrophen Membran im Insektendarm
Chitinsyntheseinhibitoren z.B. Dimilin,
Chitinasen,
Enhancin (Metalloprotease) aus B.
thuringiensis erhöht Empfindlichkeit für
Bt-Toxine
Chemische Struktur:
Chitin (α, β, γ = Ausrichtung der Chitinketten)
3-13 (40)% und Proteine, Proteine (14 – 200
kDa) teilweise glycosyliert,erstes isoliertes
Protein: Peritrophin-44
Chitin/Protein-Interaktionen (Chitin-
Bindungsdomänen; Cystein-Reste)
Insect intestinal mucine (IIM; Glykoproteine)
ebenfalls mit Chitinbindungsstellen
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 2

Molekulare Identifizerung der Nahrung (Räuber)
• Bei Räubern im Freiland Nahrungserwerb schwer zu beobachten
• Reste in Fäzes lassen oft keine sichere Aussage zu
• Molekulare Techniken (Enzym-Elektrophorese, Antikörper, PCR für
Beute-DNA)
Aus: Symondson, Molec. Ecol.
11, 627-641, 2002
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 3

Nukleinsäuren / PCR
bugguide.net
IST, internal transcribed spacer
Aus: Symondson, Molec. Ecol.
11, 627-641, 2002
Coleomegilla maculata frißt Blattäuse,
Insekteneier und Pollen
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 4

Peritrophe Membran als Barriere gegenüberer Allelochemikalien aus der Nahrung
en.wikipedia.org
Aus; Barbehenn, Arch.
Insect Biochem. Physiol.
47, 86-99, 2001
nwiassoc.com
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 5

Molekulare Antworten im Insektendarm auf Allelochemikalien in der
Nahrung
• Beispiel Sojabohnen Cystein Protease-Inhibitoren (Cystatin) aus der Nahrung beim
Bohnensamenkäfer Callosobruchus maculatus
• Up-Regulation Inhibitor-insensitiver Proteasen und Carbohydrasen im
Mitteldarmgewebe
• Induktion von Genen zur Speicherlipidmobilisierung (Energieversorgung)
• Down-Regulation von Strukturproteinen z.B. Kollagen-Transkripte und azelluläre
peritrophe Matrixproteine (z. B. Darmmucin)
• Down-Regulation von Stress-Toleranzgenen
beheco.oxfordjournals.org
Aus: Chi et al., Insect Mol.
Biol. 18, 97-110, 2009
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 6

Anpassungen bei blutsaugenden Arthropoden gegenüber Häm-Toxinen
• Nur 14,000 von mehreren Mill.
Arthropodenarten sind
hämatophag
• Hämatophagie mehrmals
unabhängig voneinander
entstanden, aber konvergente
Lösungen (Hämaggregation,
Hämabbau im Mitteldarm,
Bereitstellung von Antioxidantien,
Hämbindungsproteine in der
Hämolymphe)
• Freisetzung von Häm im
Mitteldarm, ein cytotoxisches
Molekül
Aus: Graca-Souza et al., Insect Biochem.
Mol. Biol. 36, 322-335, 2006
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 7

Proteintransport über die Darmwand der Arthropoden
Bei blutsaugenden und nicht-blutsaugenden Arten
Aus. Jeffers and Roe, J. Insect Physiol. 54, 319-332, 2008
www.jamesmagno.globolog.com
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 8

Nicht-blutsaugende Insekten:
commons.wikimedia.org
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 9

Mechanismen des Proteintransports
• „Leaky Midgut“: Transport über interzelluläre Spalten des vorderen Mitteldarms
• z.T. Aufnahme in Darmzellen über Mikrovilli (intrazellulärer Transport)
• kein Nachweis für Pinocytose oder spezifische, rezeptorvermittelte Aufnahme
• Techniken zur Verstärkung des Stofftransports über den Verdauungstrakt (z.
B. Lectine als Fusionsproteine und Transporteur)
Aus: Vinokurov et al., Arch. Insect Biochem. Physiol. 70, 254-279, 2009
GNA = mannose-specific snowdrop lectin, Galanthus nivales Agglutinin
PEG = protein lipophilic-polyethylene glycol polymers.
Die meisten Nahrungsproteine werden aber durch (spezifische)
Mitteldarmprotease abgebaut (Cystein-Peptidasen, Serin-Peptidasen
mit Trypsin-, Chymotrypsinpeptidase und Elastase = Endopeptidasen
mit z.B. C oder S im aktiven Zentrum)
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 10

Nicht-pathogene Darmbakterien
• Celluloseverdauung bei Insekten (78 Arten aus 20 Familien)
• mittels symbiontischer Protozoa und Bakterien im Enddarm (z.B. niedere Termiten)
• mittels Bakterien im Enddarm (höhere Termiten)
• mittels Cellulasen aus Pilzen, die mit der Nahrung aufgenommen werden
• mittels insekteneigenem Cellulasesystem
de.wikipedia.org
Aus: Dillon and Dillon, Annu. Rev.
Entomol. 49, 71-92, 2004
www.holzfragen.de
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 11

Warum ist Celluloseverdauung bei Insekten so selten?
• geringer Kohlenhydratbedarf gedeckt durch Sucrose und andere Oligosaccharide
aus Pflanzen (leichter verdaubar)
• limitierende Faktoren in der Nahrung sind Stickstoff und Wasser
• Celluloseabbau zu langsam, um z.B. Betriebsstoffe für Flug bereit zu stellen
• Celluloseabbau bei Poikilothermen unter 10°C kaum möglich
• Mikroorganismen in Cellulose-verdauuenden Arten stellen Eiweiß und
Nukleinsäuren bereit
A wood-eating termite (top) next to
a gut removed from a separate
individual (middle). Microscopic
examination of diluted hindgut
contents (bottom) reveals an
abundance of spirochetes (arrows)
and protozoa (P)."
Image courtesy: John Breznak,
Michigan State University
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 12

Molekulare Charakterisierung der Darmbakterien von
Nasutitermes sp. und anderen
www.chem.unep.ch
• Fibrobacter und Spirochaeta
• Vertreter der Fibrobacter auch im Pansen
von Wiederkäuern
• Spirochaeta zur reduktiven Acetogenese
befähigt, Reduktion von CO 2 zu Acetat
Aus: Brune, TRENDs Biotech. 16, 16-21, 1998
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 13

Symbiontische Bakterien in den Mycetocyten von Blattläusen:
Bereitstellung von essentiellen Aminosäuren
Section of aphid (Aphis fabae)
hybridized to FITC-labelled Buchneraspecific
16S rDNA probe (green) and
counterstained with DAPI (blue). The
cytoplasm of mycetocytes packed with
Buchnera cells is green. The
mycetocyte nucleus and other aphid
nuclei are stained blue with DAPI
(Micrograph of S. Chandler)
Aus: Douglas, Annu. Rev.
Entomol. 43, 17-37, 1998
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 14

• Symbiose 160 – 280 Mill. Jahre alt
• sekundärer Verlust bei einigen Aphiden-Familien (Hormaphididae)
• Weitergabe über das Ovar in die nächste Generation
• Mutualismus, obligat endosymbiontisch
• 60-80 Mycetocytenzellen pro Blattlaus, bis 6x10 6 Bakterien pro Blattlaus in Symbiosomen
• Buchnera- Genom seit 2000 aufgeklärt (ein 640,681 bp Chromosom und zwei kleine
Plasmide) (Proteobacteria) (Nature 407, 81-86, 2000)
• Gene für die Biosynthese von essentiellen Aminosäuren
Rosa: Wege (Gene) in
Buchneria nicht gefunden
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 15

Nature 407, 81-86, 2000
Gesamtstoffwechsel von Buchnera
Buchnera
(Photo by M.
Morioka
The bacteriocyte
of the aphid
(Photo by T.
Fukatsu).
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 16

Insektenpathogene als biologische Kontrollagentien
Perforation der Darmmembran
(Zell-Lysis)
plantprotection.blogfa.com
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 17

Gene Crystal shape Protein size(kDa) Insect activity
cry I [several subgroups:
A(a), A(b), A(c), B, C, D,
E, F, G]
bipyramidal 130-138 lepidoptera larvae
cry II [subgroups A, B, C] cuboidal 69-71 lepidoptera and diptera
cry III [subgroups A, B, C] flat/irregular 73-74 coleoptera
cry IV [subgroups A, B, C,
D]
Bt Toxine und ihre Klassifikationen
bipyramidal 73-134 diptera
cry V-IX various 35-129 various
Resistenzen gegen Bt vereinzelt beobachtet (z.B. reduzierte Bindung der
Toxine an den Mitteldarmepithelmembran). Bisher kaum Kreuzresistenzen mit
anderen Insektiziden beobachtet (unterschiedliche Wirkmechanismen). Wirken
nicht bei Pflanzensaftsaugern (Homoptera).
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 18

Toxinverabreichung:
• Zielorganismen: Lepidoptera, Coleoptera, Diptera
• formulierte Produkte im Handel (Suspensionen, Pulver, Mikrokapseln)
• transgene Pflanzen (Bt-Mais)
• endophytische Bakterien z.B. Bacillus cereus
• Pflanzenbesiedelnde Bakterien z.B. Rhizobium leguminosarum
Ear samples from a 1997 field trial. Non-Bt hybrid is
heavily damaged by insect feeding and Fusarium ear
rot, but the near-isogenic Bt hybrid has little or no
damage.
www.plantmanagementnetwork.org
Two types of Bt commonly found in
Thailand: trade names Florbac (Bt
aizawai) and Bactospeine (Bt
kurstaki).
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 19

Baculoviren – baculum = Stock/Stab
Nukleopolyhedrovirus (NPV) Granulovirus (GV)
__________________________________________________________
Doppelsträngige, filamentöse DNA-Viren, die ausschließlich Wirbellose
(Motten, Pflanzenwespen, Moquitos, Garnelen) befallen. Einsatz in der
Landwirtschaft zur Kontrolle von Schadinsekten
Einzelne (SNPV) oder mehrere (MNPV) ein Nukleokapsid pro Hülle
Nukleokapside pro Hülle ein Virion pro Granulinmatrix
Autographa californica multicapsid
Nukleopolyhydrovirus aus der
Gammaeule A. californica
www.flickr.com
de.wikipedia.org
Virionen = Nukleokapsid + Hülle
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 20

de.wikipedia.org
Lebenszyklus der Baculoviren
Auflösung der Proteinhüllen im Darmtrakt, freie
Viren heften sich an Darmepithelzellen, Aufnahme
per Endocytose in ein Endosom, Transport durch
Aktin-Filamente in den Zellkern, dort Replikation.
Erzeugung unbehüllter Viren (BV-Partikel).
Zelllysis.
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 21

Lacey et al., Biol. Contr. 21, 230-248, 2001
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 22

Rekombinante Baculovirussysteme
• Kombination von Pathogenität der Viren mit insektizider Aktivität aus
Giftes, Hormones oder Enzymes
• Endotoxine aus B. thuringiensis, Skorpionsgifte
• Diuretisches Hormon aus M. sexta, PTTH aus B. mori
• Juvenilhormon-Esterase aus H. virescens
• „Industrielle Herstellung“ einfacher rekombinanter Proteine
• Baculovirus-Expressionssysteme käuflich
www.genscript.com
Pt = Terminationssequenzen des Polyhedrin-Gens
Schema der Klonierung von eukaryontischen Antikörper-Genen
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 23

Trypsin-modulating oostatic factor (TMOF)
• Ein Decapeptid aus dem Ovar von Aedes aegypti
• YDPAPPPPPP-COOH, linksdrehende α-Helix
• Hemmt zu 50-90% Trypsin-Biosynthese im
Mitteldarm (und damit die Vitellogenese- oostat)
• Wirkt nicht wie gängige Trypsin/Protease-
Inhibitoren (Proteinhydrolyse), sondern bindet
an spezif. Darmepithelzell-Rezeptoren (K d = 10 -7 M)
und verhindert die Trypsin-Biosynthese (Translation)
• TMOF-Biosynthese im Ovar 18 h nach Blutmahlzeit
• Klonierung und Expression von Aea-TMOF in Hefe
Aus: Borovsky, J. Exp.
Biol. 206, 3869, 2002
Fourfold magnification of the
binding region. PM, peritrophic
membrane; Lu, gut lumen; He,
hemolymph side of the gut.
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 24

Expression von TMOF im Tomaten Prosystemin-Gen
• Systemin, ein Signalpeptid das bei Verwundung lokal und systemisch
aktiviert wird
Aus: Tortiglione et al., Plant Molec. Biol. 53,
891-902, 2003
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 25

Protease-Inhibitoren aus Pflanzen
• Systemin-induzierte Expression von Proteaseinhibitoren
• Akkumulation in verwundeten Pflanzenteilen
• Proteaseinhibitoren = Endopeptidasen und Exopeptidasen
• Proteinaseinihibitoren = Endoeptidasen
• Serin-Proteinase-Inhibitoren (Lepidoptera, Hymenoptera, Orthopteroidea,
Diptera), Cystein-Proteinase-Inhibitoren (Coleoptera und Hemiptera),
Asparaginsäure-Proteinaseinhibitoren, Metalloproteasen
• Wirkungsmechanismen: aufgenommene Nahrung triggert die Synthese
und Freisetzung von Proteasen aus den vorderen Mitteldarmepithelzellen
• Freisetzung in den ectoperitrophen Raum
• Proteaseinhibitoren binden
an Proteasen (K D = 10 -7 to 10 -14 )
Aus: Ryan, Annu. Rev. Phytopath. 28, 425, 1990
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 26

(2002)
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 27

Aus: Horton/Moran/Scrimgeour/Perry/Rawn,
Biochemie, 4. Auflg., Pearson, München
Praktische Anwendung
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 28

Gossypol = Sesquiterpen
Verfütterung
doppelsträngiger RNA
(dsRNA) aus transgenen
Pflanzen
Aus: Price and Gatehouse, Trends Biotechnol. 26,
393, 2008;
Baum et al., Nature Biotechnol. 25, 1322, 2007
western corn rootworm (WCR, Diabrotica virgifera;
Molekulare Ökologie (6) Hoffmann SS 2012 Coleoptera)
29

Regulation der Pheromonbiosynthese und
olfaktorische Rezeptoren
Duftstoffe (Aromastoffe), Geschmacksstoffe und Pheromone, Chemorezeption
Steuerung der Pheromonbiosynthese (Bombykol und Ipsenol)
Pheromondrüsen-spezifische Gene
Juvenilhormon III-Abhängigkeit der Ipsenol-Biosynthese
Olfaktorische (OR) und gustatorische Rezeptoren (GR)
Olfaktorische Rezeptoren (Pheromonrezeptoren), G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren
Pheromon-Bindeproteine (odorant binding protein, chemosensory protein)
Sexualdimorphismus, Expressionsmuster, Signalkaskaden, Signaltermination -
„functional genomics“
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012
1

Duftstoffe- Aromastoffe:
Niedermolekulare Stoffe (< 300 Da), z.T. „Fremdstoffe“, flüchtig, aktivieren
olfaktorische Neuronen, induzieren Duftwahrnehmung
Pheromone: z. B. Geschlechts-, Alarm-, Aggregations-, Spurpheromone
Intraspezifische Botenstoffe, die ein stereotypes Verhalten und/oder eine
hormonale Antwort auslösen. Chemisch sind es Proteine, kleine und flüchtige
Moleküle (Kohlenwasserstoffe) oder eine Kombination von beiden
de.wikipedia.org
Pheromondrüsen Porus des männlichen
Dermestes maculatus (3 Tage alt)
de.wikipedia.org
Männliche Pheromondrüse. Histologischer Querschnitt
durch das 4. Abdominalsegment eines Männchens. a:
Pheromondrüse, b: Längsmuskulatur, c: Testes, d:
Darm und e: Quermuskulatur
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 2

Nach: Sergio Angeli, Göttingen
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 3

Das Sexualpheromon Bombykol aus Bombyx mori
Bombykol
www.sinnesphysiologie.de
Aus: Ando et al., Agric. Biol. Chem. 52, 473478, 1988
E10, Z12-16:OH = Bombykol
(E) (entgegengesetzt) für trans steht und (Z) (zusammen) statt cis
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 4

Regulation der Biosynthese von Bombykol:
RNA-Interferenz mit Pheromondrüsen-spezifischen Genen
• Fettsäure-Acyl Reduktase (pgFAR)
• Z11/Δ10,12 Desaturase (Bmpgdesat1)
• Acyl-Co-bindendes Protein (pgACBP)
• PBAN (pheromone biosynthesis activating neuropeptide) Rezeptor (PBANR)
pg = pheromone gland, mg = midgut
Aus: Ohnishi and Matsumoto, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 103, 4398-4403, 2006
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 5

Aus: Ohnishi and Matsumoto, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 103, 4398-4403, 2006
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 6

PBAN und sein Rezeptor
• PBAN ein Pyrokinin-verwandtes Neuropeptid aus dem Suboesophagealganglion
• direkte Wirkung auf die Pheromondrüsenzellen (G-Protein-gekoppelter Rezeptor)
Aus: Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 100, 9721-9726, 2003
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 7

Aggregationspheromone Ipsenol und Ipsdienol
Der adulte Borkenkäfer, Ips pini
Phloem
http://www.entomology.umn.edu/
Faculty/Seybold/ResInt.html
Synthese in Mitteldarmzellen, Abgabe
durch die Männchen mit Exkrementen
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 8

Regulation der Biosynthese durch JH III bei Ips pini, aber nicht bei
I. grandicollis und I. paraconfusus (außereuropäische Arten)
Aus: Tillman et al., J. Chem. Ecol. 30, 2459-2494, 2004
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 9

• Phloemfütterung führt bei beiden Arten zu erhöhter Transkription und
erhöhter Aktivität beim Schlüsselenzym HMG-Co-Reduktase
• JH-III Behandlung führt bei beiden Arten zu erhöhter Transkription für die
HMG-Co-Reduktase, aber nur bei I. pini Männchen zu einer erhöhten
Aktivität des Enzyms
Ips pini I. paraconfusus
Aus: Tillman et al., J. Chem. Ecol. 30, 2459-2494, 2004
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 10

Aus: Tillman et al., J. Chem. Ecol. 30, 2459-2494, 2004
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 11

Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 12

Olfaktorische (OR) und gustatorische Rezeptoren (GR)
Aus: Jacquin-Joly and Merlin,
J. Chem. Ecol. 30, 2359-2397,
2004 OR und GR bei Insekten:
D. melanogaster 62 68
A. gambiae 79 72
A. mellifera 150 13
T. castaneum 341 62
B. mori 66 14
Die Pheromonrezeptoren der Insekten sind olfaktorische Rezeptoren (OR).
Wirbeltiere haben spezielle Pheromonrezeptoren V1Rs, V2Rs.
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 13

Olfaktorische Rezeptoren der Insekten sind G-Protein-gekoppelte
7-Transmembranrezeptoren
Aus: Jacquin-Joly and Merlin, J. Chem. Ecol. 30, 2359-2397, 2004
BLAST: basic local alignment search
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 14

Der Bombykol-Rezeptor bei Bombyx mori
Aus: Sakurai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
101, 16653-16658, 2004
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 15

In situ – Hybridisierung (whole mount)
PBP = pherome binding protein
Aus: Sakurai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
101, 16653-16658, 2004
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 16

Aus: Sakurai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
101, 16653-16658, 2004
Spezifität für den Liganden Bombykol
BmGαq = G-Protein
α-Untereinheit aus B.
mori
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 17

Der Pheromonrezeptor von Heliothis virescens (HR)
• 21 Isoformen, die fast ausschließlich in der Antenne der Männchen exprimiert
werden
• Gesamthomologie auf der Ebene der Aminosäuren 8-15 %, aber in einzelnen
Gruppen bis 52 %
• Colokalisierung der Expression von HR und PBP in der Antenne
Noctuidae auf Baumwolle
www.inta.gov.ar
Aus: Krieger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101,
11845-11850, 2004
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 18

Signalkaskade für Pheromonrezeptoren
Bei B. mori BmOR1/BmOR2 keine Abhängigkeit von cAMP, IP3, DAG, ATP, GTP gefunden!
Antwort bei Insekten (18-
25 msek) viel schneller als
bei Wirbeltieren (50-100
msek).
Signal geht an die
Antennalloben im Gehirn.
Neuroforum 2002/2 -
Heisenberg, Martin
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 19

Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 20

Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 21

Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 22

Signaltermination
Aus: Jacquin-Joly and Merlin, J. Chem. Ecol. 30, 2359-2397, 2004
Der Arrestin-Rezeptor-Komplex bewirkt
die Rekrutierung von Clathrinmolekülen
zur Plasmamembran. Die entstehende
Clathrinhülle löst die Abschnürung von
Vesikeln aus, die den Arrestin-Rezeptor-
Komplex enthalten, was als
Rezeptorinternalisierung bezeichnet wird.
Selber Vorgang wie bei der photoelektrischen
Transduktion (Rhodopsin). Es
gibt aber auch eine Arrestin-unabhängige
GPCR Internalisierung. Andere Arrestine
wirken als Transkriptionsregulatoren.
Molekulare Ökologie (7) Hoffmann SS 2012 23

Hormon- und Vitellogenin/Lipophorin-Rezeptoren
G-Protein-gekoppelte Peptid- und biogene Amin-Rezeptoren
Ecdysteroidrezeptoren EcR und USP
Juvenilhormonrezeptor, USP, E75A Kernrezeptor, Methoprene-tolerant Gen
Wechselwirkungen Ecdysteroid- und Juvenilhormon-Signalwege
Vitellogeninrezeptoren, Lipophorinrezeptoren, Struktur, Domänen
Vergleich zu Vertebraten Lipophorinrezeptoren LDLR, LPR (lipophorin
receptor-related) 8, VgR, VLDLR
Ovar-Follikelwachstum, Oogenese und Vitellogenese, Expression der
Rezeptoren
Lipophorinrezeptoren im Fettkörper
A. Buschinger
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012
1

Die Hormonrezeptoren der Insekten
• G-Protein-gekoppelte Rezeptoren für (Neuro)peptide und biogene Amine
• Ecdysteroidrezeptoren
• Juvenilhormonrezeptoren
Aus: Hauser et al., Progr. Neurobiol. 80, 1-19, 2006
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 2

30-50 Precursorgene mit bis zu 100
Neuropeptiden pro Art. Rezeptorzahl ?
Aus: Hauser et al., Progr. Neurobiol.
80, 1-19, 2006
www.steve.gb.com
www.funet.fi
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 3

Torso (eine Rezeptor Tyrosinkinase) als PTTH-Rezeptor
Ras = G-protein
Raf = proteinkinase
ERK extracell. signal
regulated kinase
(terminale MAPK)
Expression von Torso in den Prothoraxdrüsen
von Drosophila L3 Larven
Rewitz et al. (2009) Science 326: 1403-1405
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 4

www.biochemistry.ucr.edu
USP = ultraspiracle
Ecdysteroidrezeptor EcR und USP
Intrazelluläre oder Kernrezeptoren
Aus: Spindler, Vergleichende
Endokrinologie, Thieme, Stuttgart
www.idensystem.k.u-tokyo.ac.jp
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 5

Juvenilhormonrezeptoren USP, E75A und Met-tolerant (?)
• JH kann die Expression von Ecdysteroid-induzierten Genen modifizieren
• Der Transkriptionsfaktor E 75 scheint in allen Entwicklungsstadien wichtig zu sein
• Zwei Kandidaten für JH-Rezeptoren: USP und Met
• Bei Drosophila sind Met-Mutanten voll lebensfähig und die USP-Ligandendomäne
scheint JH nicht sehr gut binden zu können
• JH aktiviert schnell und spezifisch die Expression des E75A Kernrezeptor Gens
Aus: Jones & Sharp, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13499-13503, 1997
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 6

Das E75A Kernrezeptor Gen
Aus: Dubrovsky et al., Dev. Biol. 268, 258-270, 2004
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 7

Met, ein 79 kDa Protein bindet JH III mit hoher Affinität, auch in vitro
Aus: Miura at el., FEBS
Journal 272, 1169-1178, 2005
Kd = 5,3 + 1,5 nM
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 8

Die Struktur von Met aus Tribolium castaneum
EGFP = epidermal growth factor precursor
Aus: Konopova & Jindra, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 104, 10488-10493, 2007
Gce = germ cell expressed
Wirkungsweise von Met
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 9

Ein Modell zur Wechselwirkung von 20-OHE und JH bei Häutung
und Metamorphose
Aus: Li et al., J. Biol. Chem. 282,
37605-37617, 2007
Larvalhäutung Metamorphose
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 10

Bitra and Palli (2009) Arch.
Insect Biochem. Physiol.
70, 90-105
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 11

Alternative Wirkung lipid-löslicher Signalmoleküle: Lipidaktivierung
von Proteinen
• Wirkung von Steroiden und JH auch via Membranrezeptor und Proteinkinase C
(PKC) und Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPK)
• Ähnliche Signalwege bei lipidlöslichen Vitaminen, Prostaglandinen, Isoprenoiden,
Abscisinsäure (Pflanzen) und Differentiation-inducing factor-1 (DIF-1) (Protisten)
Aus: Wheeler and Nijhout,
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 BioEssays 25: 994-1001, 2003
12

Vitellogenese
Tiere leiten die Vitellogenese in Antwort
auf Schlüsselreize ein, wie Umweltbedingungen
oder Entwicklungsprogramme.
Der Stoffwechselweg beginnt
zentral im Gehirn und löst eine hormonelle
Kaskade aus, die biosynthetisches
Gewebe veranlasst, Vitellogenin zu
produzieren und zu sezernieren. Dieses
Protein passiert die Follikelzellen und wird
von den Oocyten aufgenommen,
gespeichert und dann in Vitellin
umgewandelt. Wirbellose und Wirbeltiere
unterscheiden sich in den spezifischen
Hormonen und Zielgeweben, doch der
allgemeine Ablauf ist ähnlich. Manche
Insekten erhöhen Expression des Vg-
Gens erst nach einer Protein (z.B. Blut-)
Mahlzeit = Anautogenie.
Aus: Moyes/Schulte, Tierphysologie, Pearson, München
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 13

Vitellogenin- / Lipophorin-Rezeptoren
• Während der Oocytenentwicklung werden mittels Endocytose die Dotterproteine
Vg (Vitellogenine) und Lp (Lipoproteine) aufgenommen (Transport aus Fettkörper über die
Hämolymphe)
• Die VgRs und LpRs gehören zur Familie der LDL-Rezeptor-Superfamilie und sind
membrangebundene Rezeptoren
EGF = epidermal growth factor
Y = Tyrosin, W = Tryptophan,
T = Threonin, D = Asparaginsäure
LBD reich an Cys
Aus: Tufail and Takeda, J. Insect
Physiol. 55: 88-104, 2009
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 14

Aus: Van der Horst und Rodenburg (2010) J.
Insect Physiol. 56: 844-853.
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 15

Aus: Tufail and Takeda, J. Insect
Physiol. 55: 88-104, 2009
Aus: Shu et al., Insect Molec. Biol., 2010
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 16

Expression der VgR und LpR mRNA
• VgR sind ovariengebundene Rezeptoren
• LpR werden in vielen Geweben exprimiert, z.B. Ovar, Fettkörper, Mitteldarm,
Gehirn, Testes, Malpighische Gefäße, Muskel
• Aufnahme der Vg in die Oocyte mittels rezeptorvermittelter Endocytose
ISH = in situ
Hybridisierung
ICC = Immunocytchemie
Cortex der Oocyte
Aus: Tufail and Takeda, J. Insect Physiol. 55: 88-104, 2009
VgRs
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 17

Aus: Tufail and Takeda,
J. Insect Physiol. 55: 88-
104, 2009
Ovariolen der Honigbiene
LpRs
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 18

Expression des Lipophorin-Rezeptor Gens in Leucophaea maderae
Aus: Tufail et al., Insect Mol. Biol., 2009, doi:10.1111/j.1365-2583.2009.00865.x
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 19

Suppression der BgLpR Expression und der Einlagerung von
ApoLpI in die Oocyten mittels RNA Interferenz
Aus: Ciudad et al., BMC Mol. Biol. 8, 53, 2007
Blattella germanica
LpR Expression im Fettkörper zur Aufnahme von HDLp (Lipide) in die Fettkörperzellen
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 20

RNA-Interferenz des Vitellogeninrezeptors aus der Königin der Feuerameise
Solenopsis invicta
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 21

Vitellogenin-Rezeptor der amerikanischen
Hundezecke, Dermacentor variabilis
• Ligandenbindungs- Domänen
• Epidermaler Wachstumsfaktor- Domänen
• O- verbundene Zucker- Domäne
• Transmembran- Domäne
• Cytoplasmatische Domäne
Mitchell III RD et al. (2007) Molecular characterization, tissuespecific
expression and RNAi knockdown of the first vitellogenin
receptor from a tick. Insect Biochem. Mol. Biol. 37: 375-388

Größten Ähnlichkeiten mit den
Zusammensetzungen der
Rezeptoren der Schaben
Periplaneta americana und
Blattella germanica
Mitchell III RD et al. (2007) Molecular
characterization, tissue-specific expression
and RNAi knockdown of the first vitellogenin
receptor from a tick. Insect Biochem. Mol.
Biol. 37: 375-388
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 23

• A: Gewebespezifische
Expression bei verpaarten
Weibchen
• C: Expression in Ovarien
abhängig vom Tag der
Ablösung vom Wirt
• B, D, Kontrollen mit Aktin
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 24

Mitchell III RD et al. (2007) Molecular characterization, tissue-specific expression and RNAi knockdown of the
first vitellogenin receptor from a tick. Insect Biochem. Mol. Biol. 37: 375-388
A) RNAi- behandelte
Ovarien (Tag 1 nach
Ablösung)
B) RNAi- behandelte
Ovarien (Tag 2)
C) PBS- Behandlung
(Tag 1)
D) PBS- Behandlung
(Tag 2)
Molekulare Ökologie (8) Hoffmann SS 2012 25

Seidenproduktion bei Arthropoden
Seidenproduktion bei Chelicerata, Myriapoda und Hexapoda; Mollusca (Byssus);
Crustacea (Amphiposa)
Spinndrüse der Chelicerata, Labialdrüsen der Insekten (ektodermale Zellen), aber
auch Malpighische Gefäße, Darm etc.
Strukturelemente der Spinnseidenproteine und die Struktur des Spinnseidenfadens
Struktur und Steuerung der Insektenspinndrüsen (Bombyx mori)
Molekulare Struktur der Insektenseidenproteine (Fibroine, Sericine)
Rekombinante Herstellung von Spinnseidenproteinen, biotechnologische Produktion
von Spinnseide
Biotechnologische Nutzung von Seidenproteinen
upload.wikimedia.org
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 1

Seidenproduktion im Tierreich
• Phylum Mollusca: Byssusfäden der Bivalvier
• Phylum Arthropoda, Subphylum Myriapoda, Klasse Symphyla
• Subphylum Chelicerata, insbesondere Ordnung Webspinnen
(Araneae)
• Subphylum Crustacea, Ordnung Amphipoda
• Klasse Hexapoda (Insekten), diverse Ordnungen
www.norvan-cps.org
Tolweb.org
Um nicht von der Strömung mitgerissen zu
werden, muss sich das Tier festhalten. Mit Hilfe
einer Drüse an der Fußbasis bildet die Muschel
zugfeste Eiweißfäden, die Byssusfäden, die sie
dann mit ihrer Fußspitze am Untergrund
befestigt. Als fester Grund dienen ihr z.B. Steine,
Holzpfähle und v.a. ihre eigenen Artgenossen.
Die Byssusfäden dienen der Miesmuschel aber
auch zur Fortbewegung. www.uni-duesseldorf.de
Symphyla (Zwergfüßer): Ein Paar Spinndüsen
am praeanalen Segment (Segment 13),
verbunden mit Spinndrüsen.
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 2

Neue marine Seide der Amphipoda
- der röhrenbildende Amphipod Crassicorophium bonellii
Kronenberger et al. (2012) A novel marine silk.
Naturwissenschaften 99, 3-10
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 3

Das Seidennetz der Spinnen
• ca. 38 000 Spinnenarten bauen ein Seidennetz zum Beutefang (fliegende
Insekten)
• Radnetz, Trichternetz, Baldachin u.a. Formen
• Spinndrüsen produzieren zeitlebens Seide
www.pets-und-co.de
Aus: Römer und Scheibel, Chem. in uns. Zeit 41, 306-314, 2007
www.csulb.edu
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 4

Insekten
Fangnetze
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 5

Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 6

Sericine
Fibroine
Labialdrüsen der Insekten
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 7

Struktur eines Seidenfadens am Beispiel der Spinne
• ein Kompositmaterial, hauptsächlich aus Proteinen
• vor der Verspinnung ohne Sekundär- und Tertiärstruktur in der Spinndrüse (Gel)
• Strukturbildung während der Assemblierung zum Faden (Filament, Nanostrukturen)
Aus: Römer und Scheibel, Chem. in uns. Zeit 41, 306-314, 2007
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 8

Bei der Spinnenseide sind die hydrophoben, konservativen C-terminalen
nicht-repetitiven Domänen der Seidenproteine an der Kontrolle des
Übergangs von der löslichen (Speicher)form zur Faserbildung beteiligt:
Aus: Hagn et al. (2010) Nature 465, 239-242
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 9

Aus: Hagn et al. (2010) Nature 465, 239-242
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 10

Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012
Ähnlicher Prozessablauf in
der Labialdrüse der Insekten
Aus: Römer und Scheibel,
Chem. in uns. Zeit 41, 306-
314, 2007
E = Elastizität
11

Die molekulare Struktur der Seidenproteine
F = Fibroine
Aus: Sutherland et al.,
Mol. Biol. Evol. 24,
2424-2432, 2007
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 12

Aus: Sutherland et al. Annu. Rev.
Entomol. 55: 171-188, 2010
Von der löslichen
Speicherform zu extrem
stabilen Fasern
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 13

Die Seidenproteine der Lepidopteren- hoch konservativ seit
150 Mill. Jahren
H-Fibroin (heavy chain), L-Fibroin (light chain) und P25-Protein (core proteins)
Ye = Yponomeuta evonymella (Gespinstmotte)
Aus: Yonemura and Sehnal, J. Mol. Evol. 63, 42-53, 2006
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 14

Aus: Yonemura and Sehnal, J. Mol. Evol. 63, 42-53, 2006
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 15

Coiled coil proteins = gewendelte aufgerollte Proteine mit 7-Einheiten
(heptad) Wiederholungen in der Aminosäuresequenz: HPPHPPP
H= hydrophobe Reste
P = polare oder geladene Reste
Strukturinformationen zur biotechnologischen Produktion von Seiden
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 16

Sericine bei Lepidopteren
(coating proteins)
a, SDS-PAGE analysis of purified sericin-like proteins. Lane 1, Mark12 TM
unstained standard; lane 2, SRC4, 15.5 kDa; lane 3, SRC8, 32.1 kDa; lane 4,
SRC12, 46.7 kDa.
b, Western-blot analysis of purified sericin-like proteins. Lane 1, SRC12, 46.7
kDa; lane 2, SRC8, 32.1 kDa; lane 3, SRC4, 15.5 kDa; lane 4, perfect Western
blot protein standards (kDa).
Aus: Huang et al., J. Biol. Chem. 278,
46117-46123, 2003
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 17

Values are given as gram of amino acid per 100 g of protein.
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 18

Aminosäurezusammensetzung mariner Seiden: CB Crassicorophium bonellii,
BC barnacle cement (Megabalanus rosa)
Kronenberger et al. (2012) A novel marine silk.
Naturwissenschaften 99, 3-10
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 19

Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 20

Expression in sf9
Insektenzellen
Schwierigkeiten:
• Repetitive Sequenzen
• Größe der Proteine- bis zu
5000 Aminosäuren
• Spinnen verwenden einen
ungewöhnlichen
genetischen Triplettcode
Expression in E. coli
Aus: Römer und Scheibel,
Chem. in uns. Zeit 41, 306-
314, 2007
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 21

Industrielle und medizinische Einsatzgebiete
Aus: Römer und Scheibel,
Chem. in uns. Zeit 41, 306-
314, 2007
• Hochleistungsfasern z.B. für
Textilien
• Nähmaterial in der Medizintechnik
• Wundverband
• Oberflächenveredelung
• Kulturmedien
• Gerüstmaterial in Gewebekulturen
und Geweberekonstruktionen
• Kosmetikprodukte
Molekulare Ökologie (9) Hoffmann SS 2012 22

Die Inner Uhr der Insekten – molekulare Mechanismen
Circadiane Uhren, endogene Natur der Uhren
Oszillation, Synchronisation, Temperaturkompensation
Lokalisation der Hauptuhr und Lichtrezeption (Input), periphere Uhren
Gene und Proteine des Uhrwerks (per, tim, clock, cycle, doubletime)
Transkriptionskontrolle, Regulation und Kerntransport
Struktureller Vergleich der Uhrproteine
Posttranslationale Regulation, Synchronisation (Entrainment),
Signalerweiterung, Signalweiterleitung (Output)
Funktionelle Analyse mittels RNA-Interferenz
www.wissenschaft.de
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012
1

Chronobiologie – Innere Uhren
• zeitliche Organisation der Physiologie und des Verhaltens von Organismen
• Biologische Rhythmen mit unterschiedlicher Periode (circannual, lunar, tidal,
circadian)
• circadiane Uhren bei Einzellern bis Mensch
• endogene Natur der Uhren
Aus: Panda et al., Nature 417, 329, 2002
Periode
Phase
Aus: Penzlin, Lehrbuch der Tierphysiologie, Spektrum/Elsevier, München, 2007
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 2

LD 14: 10 DD www.cals.ncsu.edu/.../periodic_behavior.html
Verhaltensmuster mit circadianer endogener Rhythmik:
• motorische Aktivität (Laufen, Flug)
• Gesangsaktivität bei Grillen oder Zikaden
• Oviposition
• Häutungszeitpunkt holometaboler Insekten
• Hormonausschüttung (Ecdysteroide, Juvenilhormone)
Endogene Periode
länger als 24 h
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 3

Basismodell der circadianen Uhr
Nach: Penzlin, Lehrbuch der
Tierphysiologie, Spektrum/Elsevier,
München, 2007
• Biochemische und genetische Basis der Oszillation
• Synchronisation der Oszillation mit den geophysikalischen Zyklen (Input,Entrainment)
• Übertragung der Signale der molekularen Uhr auf die Vorgänge in den Zellen bzw. auf
das Verhalten der Organismen (Output)
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 4

Synchronisation durch Licht (Zeitgeber)
Häutungsmuster einer Drosophila-
Population. Lichtphasen 10:10 h (T20),
12:12 h (T24), 14:14 h (T28).
Aus:Paranjpe et al., Chronobiol. Internat. 21, 539, 2004
Phasenverschiebung des Ruhe-/ Aktivitätsverhaltens
nach kurzer Lichtexposition zu
bestimmten Zeiten in der Nacht. Lichtpulse
am Tag haben keine Wirkung.
Aus: Penzlin, Lehrbuch der Tierphysiologie,
Spektrum/Elsevier, München, 2007
Die circadiane Uhr der Poikilothermen ist
temperaturkompensiert!
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 5

Lichtrezeption (Input) und Lokalisation der circadianen Hauptuhr
Optischer Lobus
Aus: Helferich-Förster et al.,
Neuron 30, 249, 2001
• Lichtaufnahme über Ozellen, Retina und retinale Ganglien
• Lokalisation der Uhr im optischen Lobus, laterale Neuronen (LN) und dorsale Neuronen (DN)
• Mutanten cry (ohne Cryptochrom-Photorezeptor), norpA (no receptor potential A) und glass
(ohne Retina)
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 6

Nach: Sehgal, Molecular Biology of
Circadian Rhythms, Wiley-Liss, 2004
Haupt- und periphere Uhren bei Insekten
Zentrale Uhr
Licht
(Gehirn) Periphere
Uhr
Periphere
Periphere
• Insekten besitzen mehrere autonome Uhren bezüglich der Photorezeption und der
endogenen circadianen Rhythmik. Bei Säugern werden die peripheren Uhren hormonell (?)
von der zentralen Uhr koordiniert.
• Wichtigster Zeitgeber: Licht
Untergeordnet: Nahrungsverfügbarkeit, soziale Kontakte, Temperatur, mechanische Reize
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 7
Uhr
Uhr
Signalweitergabe

Gene und Proteine des Uhrwerks bei Insekten - Transkriptionskontrolle
• period (per): exprimiert ein Kernprotein PER im 24 h Zyklus; Mutanten mit Defekt
auf Chromosom X (per) zeigen arhythmisches Verhalten
• timeless (tim): exprimiert TIM, das an PER bindet und eine Rückkopplungsschleife
bildet
• clock (clk): exprimiert Transkirptionsfaktor CLOCK
• cycle (cyc): exprimiert CYCLE, das an CLOCK bindet und die zusammen PER und
TIM aktivieren
6 h
CYC
Aus: Penzlin, Lehrbuch der
Tierphysiologie, Spektrum/Elsevier,
München, 2007
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 8

PERIOD (PER)
TIMELESS (TIM)
CLOCK (CLK)
CYCLE (CYC)
Drosophila melanogaster
Musca domestica
Periplaneta americana
Blattella germanica
Apis mellifera
Antheraea pernyi
Danaus plexippus
Bombyx mori
Strutureller Vergleich der Uhrproteine von Insekten
CLD = cytoplasmic localization domaine; NES = nuclear
export sequence; NLS = nuclear localization sequence
Aus: Helfrich-Förster,
Biochem. Soc. Trans., 33,
957, 2005
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 9

Nach Albrechts, 2005
Transkriptionale Regulation und Kerntransport
Aus: Nitabach and Taghert,
Curr. Biol. 18, R84, 2008
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 10

Kern
Posttranslationale Regulation
Cytoplasma
• DBT (double time) Kinase bindet an PER
und destabilisiert PER
• CK II (Casein-Kinase 2) destabilisiert PER
und verhindert Eintritt in den Kern
• SGG (SHAGGY) Kinase phosphoryliert
TIM und fördert den Kernimport von
TIM/PER
Weitere Kontrollfaktoren:
PP2a (Proteinphosphatase 2a), stabilisiert
PER durch Dephosphorylierung
VRI (VRILLE) Transkriptionsfaktor
PDP 1ε (PAR-DOMAINE-PROTEIN 1ε)
Transkriptionsfaktor
Aus: Gallego and Virshup, Nat. Rev. Mol. Cell.
Biol. 8, 139, 2007
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 11

Aus: Penzlin, Lehrbuch der Tierphysiologie,
Spektrum/Elsevier , München, 2007
VRI (VRILLE) Transkriptionsfaktor
hemmt Expression von clk
PDP 1ε (PAR-DOMAINE-PROTEIN 1ε)
Transkriptionsfaktor wirkt zeitversetzt zu
Vrille
Periode, Phase und Amplitude der circadianen Uhr werden durch
Phosphorylierungen reguliert:
• Progressive Phosphorylierung von PER bestimmt den Passgang der Uhr
• Synchronisation des Rhythmus mit dem Tagesgang erfolgt über den
lichtabhängigen Abbau von TIM (proteasomaler Abbau)
• Amplitude des Oszillators wird durch Phosphorylierung/
Dephosphorylierung von CLK bestimmt
• CLK und CYC sind positive Regulatoren
• PER, TIM, aber auch DBT (double time) und SGG (SHAGGY) regulieren
Beginn und Dauer der transkriptionalen Repression
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 12

TIM Protein Level
Synchronisation (Entrainment)
CRY (Cryptochrom), ein Blaulicht-
Photorezeptor aus der Flavoproteinfamilie
Aus: Dunlap, Cell 96, 271-290, 1999
Verkürzung
Verspätung
Nacht subjektiver Tag Nacht
Circadiane Zeit
Aus: Hardin, Curr. Biol. 17, R714, 2005
Lichtinduzierte Phasenverschiebung
Lichtinduzierte
Uhreinstellung
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 13

Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 14

Viele Gene werden
circadian exprimiert!
Aus: Giebultowicz, Annu. Rev.
Entomol. 45, 767-791, 2000
Signalweiterleitung
- Output
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 15

Aus: Stanewsky, J. Neurobiol. 54, 111, 2003
• Das Neuropeptid PDF (pigment dispersing factor) beeinflusst rhythmische
Aktivitäten (Schlupf, motorische Bewegung) = output/Kopplungssignal; VRI =
VRILLE
• Die Wirkung erfolgt über den Ras/MAPK (mitogen-activated protein)-Kinase Weg
• mehrere Neuronen im Gehirn (Protocerebrum) sind für PER (grau) und PDF
(schwarz) gleichermaßen immunorekativ
Helfrich-Förster, Biochem. Soc. Trans. 33, 957, 2005
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 16

Lee et al. (2009) J. Biol.
Rhythms 24, 35-43
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 17

Temperaturkompensation der inneren Uhr
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 18

Funktionelle Analyse der circadianen Uhr mittels RNA-Interferenz
• Rolle des per-Gens in Gryllus bimaculatus Larven (3. Stadium)
• Larven sind tagaktiv, adulte Tiere nachtaktiv
• Injektion von Grybi-per dsRNA bzw. dsRNA einer Koralle (DsRed2) als Kontrolle
RNA Interferenz mit
timeless-Gen zerstört
nicht die circadiane
lokomotorische Aktivität
bei G. bimaculatus!
Danbara et al., J. Insect Physiol.
56, 1838-1745, 2010
Knockdown von per
oder tim erniedrigt die
Fortpflanzungsrate bei
Schistocerca gregaria
Tobback et al., Insect Biochem.
Mol. Biol. 41, 313-321, 2011
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 19

Vergleich mit Säugetieren (Mammalia) –
Lokalisation der inneren Uhr
Arhythmik
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 20

Vergleich der Rückkopplungsschleifen Insekten-Säugetiere
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 21

Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 22

Bmal (brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT)-like)
Molekulare Ökologie 10 Hoffmann SS 2012 23

Insektenbiotechnologie – einige Beispiele
Rote, grüne und weiße Insektenbiotechnologie
Loewe-Schwerpunkt an der Universität Giessen
(Bioressourcen, Leitstrukturen aus Insekten für die
Medikamentenentwicklung, Insektenenzyme für die
industrielle Biotechnologie)
TMOF- und sein Einsatz in der Schädlingsbekämpfung
(Insektenbefall von Pflanzen, Blutsauger des Menschen)
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012
1

LOEWE-Schwerpunkt Universität Giessen
Prof. Andreas Vilcinskas
Rote Biotechnologie: Medizin
Grüne Biotechnologie: Landwirtschaft
Weiße Biotechnologie: Industrie
Biorohstoff
Insekten
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 2

Anwendungen in der Medizin (I)
Speichelsekrete von Lucilia sericata enthalten antibakterielle Substanzen (AMP),
Enzyme die nekrotisches Gewebe abbauen (Lipasen Proteinasen) und Moleküle die die
Wundheilung beschleunigen (Entwicklung neuartiger Wundverbände).
Altincicek, Vilcinskas (2009) Insect Molec. Biol. 18, 119-125
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 3

Anwendungen in der Medizin (I)
Alticicek, Vilcinskas (2008) BMC
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 Genomics 8, 326
4

Metallo-Proteinase-Inhibitoren
Anwendungen in der
Medizin (II)
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 5

Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 6

Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 7

Enzyme für die industrielle Biotechnologie
Enzymatischer Aufschluss nachwachsender Rohstoffe
Ligninabbauende Enzyme aus Insekten (z.B. Speichelsekret) bzw. Insektenassoziierten
Pilzen: Esterasen, Oxidasen Peroxidasen
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 8

Identifizierung neuer Enzyme für die Lebensmittelbiotechnologie
(Aufschluss, Konservierung): Cutinasen, Endoglykosidasen,
Oxygenasen, Peptidasen
Schwarzhörniger Totengräber
(Nicrophorus vespilloides)
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 9

TMOF und sein Einsatz in der Schädlingsbekämpfung
Hexapeptid Neb-TMOF (H-NPTNLH-OH, trypsin modulating oostatic factor of the grey
fleshfly, Neobellieria bullata)
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 10
?

• Mosquito Decapeptid (Antigonadotropin, keine Vitellogenese)
• Hormon wird vom Ovar nach Blutmahlzeit sekretiert
• stabile dreidimensionale Konformation; kein Abbau durch
Darmproteasen
• Austritt durch Darmepithelzellen
• zirkuliert in der Hämolymphe
• bindet an Darmrezeptoren (Mitteldarm) und hemmt Trypsinbiosynthese
(wirkt also nicht direkt auf das Ovar!)
• Kontrolle der mRNA Translation
• nicht artspezifisch, wirkt auch bei anderen Diptera
Borovsky D. (2003) J. Exp. Biol. 206, 3869-3875
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 11

D. Borovsky, 2007
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 12

Hemmung der
Trypsin mRNA
Translation
D. Borovsky, 2007
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 13

D. Borovsky, 2007
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 14

D. Borovsky, 2007
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 15

D. Borovsky, 2007

Verfütterung von [ 3 H]TMOF und Analoga an
Mosquitolarven
Borovsky D. (2003) J. Exp. Biol. 206, 3869-3875
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 18

Borovsky D. (2003) J. Exp. Biol. 206, 3869-3875
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 19

Live Larvae/Group + S.E.M.
Klonierung und Expression von Aea-TMOF in Hefen und
Grünalgen
30
25
20
15
10
5
0
• Saccharomyces cerevisiae
• Pichia pastoris
• Chlorella sp.
Feeding Ae. aegypti larvae Saccharomyces
cerevisiae GFP-TMOF the original strain
GFP
GFP-IEGR-TMOF
0 2 4 6 8 10 12 14
Days
GFP-IEGR
Homologous Recombination of pYDB2 into Yeast
D. Borovsky, 2007
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 20

D. Borovsky, 2007
Chlorella sp.
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 21

Herstellung von rekombinantem Protein mittels
Tabak-Mosaik Virus (TMV)
Infektion von Tabakpflanzen mit TMV-TMOF;
Verfütterung der Tabakblätter an Herbivore
Heliothis virescens
D. Borovsky, 2007
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 22

Transgene Pflanzen
Molekulare Ökologie (11) Hoffmann SS 2012 23