Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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- 96 - Abschätzung antigener Regionen des TRIM46-Proteins Die Proteinsequenz des TRIM46 wurde nach antigenen Regionen nach der Methode von Jameson-Wolf mit der Software Lasergene-DNAstar abgesucht. Es wurde eine Protein-Region in DOM5 (siehe ab Seite 66) des TRIM46-Proteins ausgewählt, die nach Blast einzigartig im Proteom sein sollte, um Kreuzreaktionen zu vermeiden. Die Firma Bioscience in Göttingen übernahm die Synthese des Polypeptids, deren Aufreinigung und anschließende Immunisierung in Kaninchen. Das Serum mit den polyklonalen Antikörpern wurde über eine Säule mit dem immobilisierten Antigenpeptid affinitätsaufgereinigt. Synthetisierte Antigensequenz: Cystein-IRHTEVSGQQAKEE Das Cystein wurde zur Kopplung an das für die Immunisierung verwendete Trägerprotein (KLH, sonst auch BSA) eingefügt und war nicht Bestandteil der Antigensequenz Die Wirksamkeit des Antikörpers wurde mittels Dotblot verifiziert. Dabei ergaben sich in Proteinextrakten aus Wildtyp-Embryonen deutliche Signale, in Extrakten von homozygoten TRIM46-KO hingegen keine oder nur schwache Signale je nach Konzentration. Für Immunfärbungen hatte sich eine Verdünnung von 1:20 für die affinitätsgereinigten Antikörper als praktikabel erwiesen. Wegen der geringen Verdünnung wurde das Material allerdings schnell aufgebraucht. BSA WT TRIM46 KO Abbildung 72: Dotblot von Proteinextrakten. Links BSA, Mitte Wildtyp-Embryo der Maus, rechts homozygoter TRIM46-KO. Der verwendete polyklonale Antikörper gegen TRIM46 erwies sich als spezifisch, da kein Signal gegen BSA, kaum gegen das Proteingemisch aus dem TRIM46-KO-Embryo auftrat, jedoch ein starkes Signal im Wildtyp. Die Konzentration wurde so gewählt, dass im TRIM46-KO kein Signal mehr zu erkennen sein sollte, im Wildtyp hingegen noch ausreichend. Zur Detektion wurde folgendes Material eingesetzt: Immobilon-P Transfer Membran, 20 x 20 cm (Cat.No. IPVH20200, Millipore), SuperSignal West Substrat Lösung (Cat.No. 34080, Pierce), Sekundärantikörper gegen Kaninchen mit Peroxidaseaktivität (Dianova). Expression im Whole-Mount-Embryo auf Organebene Vergleich von ISH, Immunfärbung und lacZ Zur Analyse der Expression von TRIM46 standen in dieser Arbeit 3 verschiedene Verfahren zur Verfügung: lacZ-Färbung gegen das im Knock-out eingefügte Reportergen β-Galactosidase, welches unter dem Promotor von TRIM46 an dessen Stelle exprimiert würde und im homozygoten sowie heterozygoten KO, jedoch nicht Wildtyp nachweisbar wäre. In-situ-Hybridisierung gegen die mRNA von TRIM46 im Wildtyp sowie heterozygotem KO. Immunfärbung gegen das TRIM46-Protein im Wildtyp sowie heterozygotem KO. Alle 3 Färbemethoden sollten zu konsistenten, d.h. Übereinstimmenden Ergebnissen führen. Somit stellte ein Vergleich der 3 Methoden auch eine weitere Kontrolle für den richtigen Knockout dar, insbesondere ob keine die Expression kontrollierenden Sequenzen wie z.B. in Introns mit ausgeschaltet wurden, die zu Abweichungen führen könnten. Die Ergebnisse dieses Vergleiches sind in den folgenden Abbildungen dargestellt.
ISH - 97 - Abbildung 73: Die Abbildungen zeigen Blutgefäße an der Oberfläche eines präparierten Gehirnes aus Maus des Entwicklungsstadiums P1. Expression von TRIM46 im Wildtyp wurde mit in-situ-Sonde (links) und Antikörper angefärbt (Mitte) bzw. im homozygoten KO mit lacZ-Färbung (rechts). Die Färbung ist nicht durchgängig gleichmäßig entlang der Gefäße und auch nicht in allen Gefäßen, sondern scheint auf bestimmte Zelltypen beschränkt zu sein. Vergleich der TRIM46-Expression mit bekannten Markern für die verschiedenen Zelltypen in Blutgefäßen konnte darüber mehr Aufschluss geben (siehe Seite 119). AK lacZ
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Die TRIM-Proteine treten mit andere
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