Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Abschätzung antigener Regionen des TRIM46-Proteins
Die Proteinsequenz des TRIM46 wurde nach antigenen Regionen nach der Methode von Jameson-Wolf
mit der Software Lasergene-DNAstar abgesucht. Es wurde eine Protein-Region in DOM5 (siehe ab Seite
66) des TRIM46-Proteins ausgewählt, die nach Blast einzigartig im Proteom sein sollte, um Kreuzreaktionen
zu vermeiden. Die Firma Bioscience in Göttingen übernahm die Synthese des Polypeptids, deren
Aufreinigung und anschließende Immunisierung in
Kaninchen. Das Serum mit den polyklonalen Antikörpern
wurde über eine Säule mit dem immobilisierten
Antigenpeptid affinitätsaufgereinigt.
Synthetisierte Antigensequenz:
Cystein-IRHTEVSGQQAKEE
Das Cystein wurde zur Kopplung an das für die
Immunisierung verwendete Trägerprotein (KLH,
sonst auch BSA) eingefügt und war nicht Bestandteil
der Antigensequenz
Die Wirksamkeit des Antikörpers wurde mittels
Dotblot verifiziert. Dabei ergaben sich in Proteinextrakten
aus Wildtyp-Embryonen deutliche Signale,
in Extrakten von homozygoten TRIM46-KO hingegen
keine oder nur schwache Signale je nach Konzentration.
Für Immunfärbungen hatte sich eine
Verdünnung von 1:20 für die affinitätsgereinigten
Antikörper als praktikabel erwiesen. Wegen der
geringen Verdünnung wurde das Material allerdings
schnell aufgebraucht.
BSA WT TRIM46
KO
Abbildung 72: Dotblot von Proteinextrakten. Links
BSA, Mitte Wildtyp-Embryo der Maus, rechts
homozygoter TRIM46-KO. Der verwendete polyklonale
Antikörper gegen TRIM46 erwies sich als spezifisch, da
kein Signal gegen BSA, kaum gegen das
Proteingemisch aus dem TRIM46-KO-Embryo auftrat,
jedoch ein starkes Signal im Wildtyp. Die Konzentration
wurde so gewählt, dass im TRIM46-KO kein
Signal mehr zu erkennen sein sollte, im Wildtyp hingegen
noch ausreichend.
Zur Detektion wurde folgendes Material eingesetzt:
Immobilon-P Transfer Membran, 20 x 20 cm (Cat.No.
IPVH20200, Millipore), SuperSignal West Substrat
Lösung (Cat.No. 34080, Pierce), Sekundärantikörper
gegen Kaninchen mit Peroxidaseaktivität (Dianova).
Expression im Whole-Mount-Embryo auf Organebene
Vergleich von ISH, Immunfärbung und lacZ
Zur Analyse der Expression von TRIM46 standen in dieser Arbeit 3 verschiedene Verfahren zur Verfügung:
lacZ-Färbung gegen das im Knock-out eingefügte Reportergen β-Galactosidase, welches unter dem
Promotor von TRIM46 an dessen Stelle exprimiert würde und im homozygoten sowie heterozygoten KO,
jedoch nicht Wildtyp nachweisbar wäre. In-situ-Hybridisierung gegen die mRNA von TRIM46 im
Wildtyp sowie heterozygotem KO. Immunfärbung gegen das TRIM46-Protein im Wildtyp sowie
heterozygotem KO. Alle 3 Färbemethoden sollten zu konsistenten, d.h. Übereinstimmenden Ergebnissen
führen. Somit stellte ein Vergleich der 3 Methoden auch eine weitere Kontrolle für den richtigen Knockout
dar, insbesondere ob keine die Expression kontrollierenden Sequenzen wie z.B. in Introns mit
ausgeschaltet wurden, die zu Abweichungen führen könnten. Die Ergebnisse dieses Vergleiches sind in
den folgenden Abbildungen dargestellt.