Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Morula-Aggregation von ES-Zellen, Keimbahntransfer und
Genotypisierung der transgenen Mäuse
Um chimäre Mäuse zu erhalten, wurden 3 positive ES-Zell-Klone (Klon-Nr. 98, 119, 269) vom
Mausstamm 129/Sv (mit schwarzen Augen) mit Morulae aggregiert (siehe Seite 163), die aus dem NMRI-
Mausstamm gewonnen wurden. Dazu musste den Morulae die Zona pellucida entfernt werden. Das
Aggregat wurde 24 h bei 37°C inkubiert.
Am nächsten Tag wurden die Embryonen in scheinschwangere (Schwangerschaftstag 2) Ammenmütter
transferiert. Es wurden dafür diejenigen Embryonen ausgewählt, die bis zum Blastocysten-Stadium
entwickelt waren. Sollten die Embryonen 17 Tage nach dem Retransfer nicht geboren werden, wurde per
Kaiserschnitt entbunden.
Der Grad des Chimärismus ist an der Fellfarbe erkennbar. Je höher der Anteil an dunkler Fellfarbe ist
(Mausstamm 129/Sv), desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass die chimäre Maus die transgene
Information auch in ihren Keimzellen trägt und somit diese Information an ihre Nachkommen weitergibt.
Nach sechs Wochen wurden die Chimären mit NMRI-Wildtypmäusen verpaart. Ein Keimbahntransfer
konnte bei den Nachkommen anhand der Augenfarbe erkannt werden. Mäuse mit schwarzen Augen
entstammten der Keimbahn den transgenen ES-Zellen (Stamm 129/Sv), wogegen Mäuse mit roten Augen
von nicht-transgenen Keimbahn-Zellen (Stamm: NMRI) abstammten. Diese F1-Generation der
Chimären war folglich heterozygot für das Transgen.
Heterozygote Tiere dieser Generation (F1) wurden miteinander verpaart, um homozygote Tiere zur
Phänotyp-Analyse zu erhalten (genetischer Mischhintergrund).
Parallel wurde begonnen, Inzuchtlinien mit dem Stamm C57 BL/6 zu züchten, der für neuronale
Fragestellungen als besonders geeignet gilt, sowie mit dem Stamm 129/Sv, der den identischen
genetischen Hintergrund wie die ES-Zellen aufwies, sowie mit CD-1. Für die Phänotypanalyse wurde im
Wesentlichen die Zucht mit dem Stamm 129/Sv verwendet.
Zur Planung und Verwaltung der Zuchtlinien wurde eine am Institut selber entwickelte Datenbanksoftware
eingesetzt. Die geborenen Tiere wurden genotypisiert, indem aus Biopsie-Material der Schwanzspitze
genomische DNA gewonnen wurde, die mittels PCR auf Wildtyp, Heterozygotie- und Homozygotie
des Transgens getestet wurden. Die PCR lieferte die gleiche Information wie die zuvor gezeigte Southern-
Blot-Analyse mit radioaktiven Sonden, war für Genotypisierungen vieler Hundert Tiere aber schneller und
nach initialer Verifikation durch Southern-Analyse auch zuverlässig.
Dabei kamen Primer (siehe ab Seite 153) zum Einsatz, die spezifisch für die lacZ-Gensequenz waren, so
dass sie eine Bande von 415 bp Größe nur in homo- oder heterozygoten transgenen Tieren zeigen sollten.
Ein weiteres Primer-Paar amplifizierte ein Fragment von 646 bp aus dem ausgeknockten Bereich des
TRIM46-Genlokus, so dass es nur bei Wildtypen sowie heterozygoten Transgenen auftauchen sollte.
Beide Primerpaare konnten in jeweils demselben PCR-Ansatz zugleich eingesetzt werden (Multiplex-
PCR), so dass es möglich war, aus dem Bandenmuster auf das Vorliegen von Wildtypen, heterozygoten
und homozygoten Transgenen zu schließen.
Beim Design der 4 Primer war auf ähnliche Annealing-Temperaturen zu achten, zudem musste die
Schmelztemperatur auf 95°C (Standard 94°C) gesetzt werden, wegen der genomischen DNA.
+/+ -/- +/- +/+
Abbildung 69: Das Bild zeigt ein Agarose-Gel mit den PCR-Produkten einer
Genotypisierung: Ein kleineres Fragment von 415 bp von den lacZ-Primern, ein größeres
Fragment von 646 bp von den Primern für die interne Bindestelle in dem TRIM46-
Genlocus. Das Vorkommen beider Fragmente deutete auf heterozygote Tiere (+/-), das
größere obere Fragment alleine auf Wildtypen (+/+), das kleinere untere Fragment alleine
auf homozygote Transgene (-/-).