Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Ausschnitt von Maus-Chromosom 3 mit TRIM46-Genlokus nach KO
20110 bp
Die Situation an dem Genlokus von TRIM46 vor und nach der homologen Rekombination zur
Integration des KO-Konstruktes ist in obigen Grafiken dargestellt. Die jeweils hinzu oder hinweg
gefallenen Schnittstellen sind unterstrichen.
Daraus folgt, dass beim Schneiden mit Xba I im Wildtyp ein Fragment von 11106 bp und eines von 10974
bp zu erwarten war, das jeweils entweder mit der 5’- oder der 3’-Sonde detektiert werden konnte. Nach
erfolgreicher Integration des KO-Konstruktes wurden stattdessen ein Fragment von 2737 bp und eines von
8850 bp sichtbar. Zusätzlich würde sich mit der lacZ-Sonde ein Fragment von 4845 bp zeigen.
Beim Schneiden mit Eco RV sollte im Wildtyp gar kein Fragment von erfassbarer Größe auftreten,
wohingegen bei KO-Integration jeweils mit der 5’- oder der lacZ-Sonde ein Fragment von 5021 bp bzw.
von 2357 bp erscheinen sollte. Die 3’-Sonde wurde in diesem Falle nicht gebraucht.
λ
Xba I (1759)
Xba I (1231)
Eco RI (737)
Eco RV (623)
117 118 119
BamHI (4537)
Xba I (4496)
ATG
5'-Sonde 5'-Flanke lacZ-pA
λ
Eco RV (5644)
ORF
Eco RI (7535)
BamHI (7991)
Eco RV (8001)
Xba I (9341)
Xho I (9627)
pGK-Neomycin-pA
94 95 96 97 98 99
Abbildung 67: Ausgewählte ES-Zellklone, deren genomische
DNA mit Xba I verdaut wurde. Die radioaktive 3’-Sonde zeigte
bei den Klonen 119 und 98 das Knock-out-Fragment von 8850 bp
zusätzlich zum heterozygot vorliegenden Wildtyp-Fragment von
10974 bp, was diese Klone positiv für den Knock-out auswies.
Zum λ-Fragmentlängenmarker siehe Abbildung 148.
Insgesamt wurden nach diesem Verfahren 300 mit dem KO-
Konstrukt elektroporierte und selektionierte ES-Zellklone
untersucht, von denen 15 sich nach den oben genannten
Kriterien positiv erwiesen, was einer Rekombinations-
Frequenz von 1:20 entspricht. Die Klone 98, 119 und 269
wurden für die Herstellung transgener Mäuse weiterverwendet,
die späteren Analysen wurden mit Mäusen durchgeführt, die
auf Klon 98 zurückgehen.
BamHI (16880)
3'-Flanke
Xba I (18191)
3'-Sonde
Xba I (18967)
Xba I (19015)
Eco RI (19510)
Eco RI (19520)
79 98 119 179 185 192 215 246 269 270
Abbildung 66: Ausgewählte ES-Zellklone,
deren genomische DNA mit Eco RV
verdaut wurde. Die 5’-Sonde zeigt das
Fragment von 5021 bp und die lacZ-Sonde
von 2357 bp außer bei den Klonen 185 und
270, die nicht vollständig sind.
98 119 179 185 192 215 246 269 270
Abbildung 68: Ausgewählte ES-
Zellklone, deren genomische DNA mit
Xba I verdaut wurde. Die radioaktive
lacZ-Sonde zeigte eine erwartete Bande
bei 4845 bp außer bei den Klonen 185 und
270 als Beispiele für Unvollständige.