Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Verdaus von 5441 bp in zwei kleinere von 2872 und 2569 bp. 6. Kpn I + Spe I -> waren wie 5. jedoch wurde
zusätzlich das größte Fragment von Kpn I von 7603 bp zerlegt in zwei kleinere von 3833 und 3770 bp, die wie eine
dicke Bande auf dem Agarose-Gel erscheinen. 7. Eco RV, 8. Xba I -> lieferten exakt die vorhergesagten
Fragment-Muster. 9. Xba I + Eco RV -> erwartungsgemäß wurden das größte und zweitgrößte Fragment von Eco
RV von 12417 und 4661 bp durch Xba I auf 11073 und 3517 bp verkleinert, wodurch zwei kleinere Fragmente von
1344 und 1144 bp hinzukamen. 10. Sac II -> lieferte erwartungsgemäß zwei Fragmente von 12393 und 7146 bp.
Gentransfer in ES-Zellen und ES Zell-Screen
Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) stammen aus der inneren Zellmasse der Mausblastocyste und
können in Kultur auf Feederzellen gehalten werden. Die Feederzellen sind Mausfibroblastenzellen, die
selber resistent für Neomycin sind, da sie aus transgenen Mäusen (CD-1.MTKNeo-2) gewonnen wurden.
Zusätzlich wurden die Fibroblasten mitotisch inaktiviert mit Mitomycin-C, nachdem sie ihre Kulturschalen
mit einem dichten Rasen bewachsen hatten. Auf diesem konnten die ES-Zellen kultiviert werden,
welche durch Zugabe von LIF (Leukemia Inhibiting Factor) an der Differenzierung gehindert wurden.
Das linearisierte Rekombinationskonstrukt wurde in die MPI-II-ES-Zelllinie (Mausstamm 129/Sv)
(Doetschman, Eistetter et al. 1985) elektroporiert und auf das homologe Rekombinationsereignis selektiert.
Es fand nacheinander eine Doppelselektion statt, wobei das Antibiotikum Geneticin ® G418
(verwandt mit Neomycin) der positiven und 24-48 h später Gancyclovir der negativen Selektion diente.
Hierbei bewirkt das in dem Konstrukt enthaltene Neomycin-Resistenzgen die Inaktivierung des Antibiotikums
G418, währenddessen etwaige vorhandene Thymidin-Kinase eine Umwandlung von
Gancyclovir in ein Zellgift bewerkstelligte. Nach dieser Selektion wurden insgesamt 300 Klone isoliert,
d.h. Einzelzellen, die die Selektion überlebt hatten.
Zur Identifizierung des homologen Rekombinationsereignisses wurde genomische DNA aus den ES-
Zellen gewonnen für die Southern-Blot-Analyse.
Die genomische DNA wurde dabei mit den Restriktionsenzymen Xba I bzw. Eco RV so verdaut, dass im
Bereich des Genlokus von TRIM46 unterschiedlich große Fragmente entstanden, je nachdem ob die
genomische Originalsequenz geschnitten wurde oder die durch den KO substituierte Sequenz. Die
geschnittenen Fragmente konnten elektrophoretisch aufgetrennt und nach Southern geblottet werden. Zur
Identifizierung der Fragmente vor dem Hintergrund anderer genomischer Sequenzen wurden zwei
radioaktiv markierte DNA-Sonden (siehe ab Seite 153) eingesetzt, die jeweils in dem gewünschten
Bereich hybridisierten. Zusätzlich wurde eine Sonde gegen lacZ eingesetzt, die aus der zwischen Eco RV
geschnittenen lacZ-Sequenz bestand.
Mit diesen 3 Sonden konnte auf erfolgreiche Integration an der 5’-Flanke sowie der 3’-Flanke und
Vorhandensein des substituierten Inserts mit lacZ dazwischen geprüft werden.
Xba I (1231)
Eco RI (737)
Eco RV (623)
5'-Sonde
Xba I (1759)
ATG
BamHI (8751)
BamHI (4681)
BamHI (6057)
Eco RI (11770)
Xho I (11146)
5'-Flanke 3'-Flanke
Ausschnitt von Maus-Chromosom 3 mit TRIM46-Genlokus
25758 bp
Xba I (12865)
Eco RI Exon10-cDNA12
(13593)
Eco RI (14540)
Xho I (15275)
BamHI (22528)
Stop-Codon TGA (opal)
Xba I (23839)
3'-Sonde
Xba I (24615)
Xba I (24663)
Eco RI (25158)
Eco RI (25168)