Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
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EcoRV (16688)<br />
EcoRV (16584)<br />
Thymidine-Kinase<br />
Bam HI (15257)<br />
5'-Flanke<br />
KpnI (14139)<br />
KpnI (13077)<br />
Xba I (13067)<br />
- 90 -<br />
Bei der ganzen Klonierung <strong>für</strong> das Konstrukt war darauf zu achten, dass bis zum Ende genügend geeignete<br />
Restriktionsschnittstellen übrig blieben <strong>und</strong> das Konstrukt <strong>für</strong> <strong>die</strong> homologe Rekombination linearisiert<br />
werden musste. In <strong>die</strong>sem Fall wurde <strong>die</strong> Planung per Hand vorgenommen, jedoch empfiehlt sich<br />
gr<strong>und</strong>sätzlich <strong>die</strong> Verwaltung mittels einer Software, in der <strong>die</strong> ganzen Vektor- <strong>und</strong> Insertsequenzen<br />
vorliegen <strong>und</strong> <strong>die</strong> Klonierungsschritte zuerst in-silico geplant <strong>und</strong> in einer Datenbank dokumentiert<br />
werden können. Auf den vorigen Seiten wurde <strong>die</strong> hier durchgeführte Klonierungsstrategie mit dem<br />
Programm Vector NTI9 zur Kontrolle noch einmal durchgerechnet, was zudem übersichtliche Grafiken<br />
geliefert hat.<br />
Die endgültige Kontrolle des Konstruktes erfolgte durch Sequenzierung über <strong>die</strong> Ligationsstellen<br />
sowie Restriktionsverdau:<br />
KpnI (17337)<br />
SacII (13057)<br />
Bam HI (13026)<br />
Eco RV (11923)<br />
SacII (664)<br />
Ampicillin<br />
pBS II-KS + TK + 5'-Flanke<br />
lacZ-pA<br />
ATG<br />
19539 bp<br />
Not I (670)<br />
+ lacZ-Neo + 3'-Flanke<br />
ORF<br />
Bam HI (9572)<br />
EcoRV (9566)<br />
SpeI (9307)<br />
SpeI (677)<br />
Bam HI (683)<br />
Xba I (8222)<br />
pGK-Neomycin-pA<br />
Abbildung 65: Verschiedene Restriktionsverdaue<br />
zur Kontrolle der richtigen<br />
Klonierung. In der Plasmid-Grafik des<br />
KO-Konstruktvektors sind <strong>die</strong> ausgewählten<br />
Restriktionsschnittstellen eingetragen,<br />
welche zum Testen verwendet wurden.<br />
Oben rechts das tatsächliche Agarose-Gel<br />
mit den DNA-Fragmentlängenmarkern λ<br />
<strong>und</strong> B (siehe Abbildung 148) sowie den<br />
mit den entsprechenden Kombinationen<br />
<strong>von</strong> Restriktionsenzymen verdauten Proben<br />
des KO-Konstruktvektors. Unten<br />
rechts das aus der bekannten Sequenz des<br />
KO-Konstruktvektors mittels Software<br />
(Vector NTI9) vorhergesagte Muster der<br />
KpnI (3239)<br />
KpnI (3665)<br />
3'-Flanke<br />
KpnI (4730)<br />
KpnI (5474)<br />
20K<br />
10K<br />
5K<br />
2K<br />
1K<br />
700<br />
500<br />
λ B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 λ B<br />
λ 1 B 2 1 3 2 4 3 5 4 6 5 7 6 8 7 9 8 10 9 11 10 12 λ 13 B14<br />
Restriktionsfragmente. 1. Not I -> linearisierte nur das KO-Konstrukt. 2. Spe I -> schnitt 2 Mal <strong>und</strong> lieferte 2 Fragmente<br />
<strong>von</strong> 10909 bp <strong>und</strong> 8630 bp Größe. 3. Bam HI -> sollte 4 Fragmente liefern, <strong>die</strong> man auch wieder findet, jedoch<br />
scheint das verwendete Enzym überaktiv geworden zu sein, weshalb unkontrollierte Schnitte entstanden oder<br />
es war verunreinigt. 4. Kpn I -> lieferte das erwartete Fragmentmuster bis auf einen Größenunterschied zur Vorhersage,<br />
<strong>die</strong> auf einen Polymorphismus in der 3’-Flanke zurückzuführen ist (Schnittstelle Kpn I 4730 ist in der<br />
realen Sequenz der 3’-Flanke nicht vorhanden im Gegensatz zur Sequenz aus der Datenbank), was <strong>für</strong> das Konstrukt<br />
aber keine Bedeutung hatte. 5. Kpn I + Not I -> zerlegten das zweitgrößte Fragment des alleinigen Kpn I –
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