Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
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- 88 - Hinzufügen von β-Galactosidase-Enzym (lacZ) im fortlaufenden Leseraster und Neomycin- Resistenz: KpnI (9792) Xho I (9773) SalI (9767) Thymidine-Kinase Eco RI (7718) pBS II-KS + TK + 5’-Flanke Spe I geschnitten und mit Klenow-Enzym geblunted + Xba I geschnitten Ampicillin pBS II-KS + TK + 5'-Flanke + lacZ-Neo.trunc 5'-Flanke Start des Gens TRIM46 auf der genomischen Sequenz der 5’-Flanke: Das β-Galactosidase-Enzym (lacZ) wurde so geschnitten und mit Klenow-Enzym zubereitet, dass es bei der Klonierung in den Zielvektor an die 5’-Flanke im fortlaufenden Leseraster mit der dort beginnenden kodierenden Sequenz von TRIM46 fusionierte. Der korrekte Übergang wurde durch Sequenzierung überprüft. 5’…ATGGCTGAGGGTGAGGATATGCAGACCTTCACTTCCATCATGGATGCACTAGTCCGCATCAGT…3’ Schnittstelle Spe I: 5’…A^CTAG T…3’ => 5’…A blunt: 5’…ACTAG 3’…T GATC^A…5’ …TGATC 3’…TGATC Anfang der lacZ-Sequenz in pKC414-lacZ-Neo: 5’…GGGCCCCCCGGGGGTACCTCTAGAATGCATTCCGCGGGTTTTCATGTACCCAGCATGGGGGATCCCGT CGTTTTA…3’ Schnittstelle Acc 65I: 11994 bp ATG Not I (670) Xba I (677) Acc 65I (26) SmaI (22) ApaI (18) KpnI (12) Acc65I (8) pGK-Neomycin-truncated SpeI (1762) Acc 65I (9788) Bam HI (2027) SacI (8930) Bam HI (7712) SacI (7416) PvuI (11449) KpnI (6594) Acc 65I (6590) SacI (657) Pvu I (500) KpnI (5532) Acc 65I (5528) ORF PvuI (5370) Bam HI (5481) Xba I (5522) Eco RI (2483) SacI (3555) PvuI (3711) lacZ-pA Pvu I (4164) Pvu I (4644) Sa cII (4 8) BamHI (73) pKC414-lacZ-Neo β-Galactosidase-Enzym (lacZ) und Neomycin-Resistenzgen wurden aus dem Vektor pKC414 durch Acc 65I und Xba I herausgeschnitten, wobei die Acc 65I- Schnittstelle mit Klenow-Enzym geblunted wurde. 5’…G^GTAC C…3’ => GTACC…3’ blunt: GTACC…3’ 3’…C CATG^G…5’ G…5’ CATGG…5’ KpnI (30) XbaI (32) lacZ-pA EcoRI (3071) 5207 bp Sp eI (3792) BamHI (3527) pGK-Neomycin-pA Xba I (4877) XhoI (5163) Sp eI (5169 ) XhoI (5175) EcoRV (1180) NotI (5182)
Acc 65I (26) SmaI (22) ApaI (18) KpnI (12) Acc65I (8) BamHI (73) Sa cII (48) XbaI (32) Ligation: - 89 - 5’…ATGGCTGAGGGTGAGGATATGCAGACCTTCACTTCCATCATGGATGCACTAGGTACCTCTAGAATGCA TTCCGCGGGTTTTCATGTACCCAGCATGGGGGATCCCGTCGTTTTA…3’ Fortlaufendes Leseraster: 5’…ATG.GCT.GAG.GGT.GAG.GAT.ATG.CAG.ACC.TTC.ACT.TCC.ATC.ATG.GAT.GCA.CTA. GGT.ACC.TCT.AGA.ATG.CAT.TCC.GCG.GGT.TTT.CAT.GTA.CCC.AGC.ATG.GGG.GAT.CCC .GTC.GTT.TTA…3’ Hinzufügen der 3’-Flanke und Rekonstitution von Neomycin: KpnI (30) XbaI (32) Sa cII (48) lacZ-pA EcoR V (118 0) Thymidine-Kinase Bam HI (15257) 5'-Flanke Acc 65I (14135) Acc 65I (13073) Xba I (13067) BamHI (73) Xho I (17318) SalI (17312) Eco RV (16688) EcoRV (16584) SacII (13057) Bam HI (13026) EcoRV (1180) lacZ-pA pGK-Neomycin-pA EcoRI (3071) pKC414-lacZ-Neo 5207 bp pGK-Neomycin-pA BamH I (3527) pKC414-lacZ-Neo + 3'-Flanke 1246 0 bp XbaI (4877) Sp e I (3792) Sp eI (5169) 3'-Flanke Not I geschnitten + Spe I partiell verdaut alternativ ginge nur Spe I Eco RV (11923) Spe I (3792) BamHI (3527) Acc 65I (17333) SacII (664) XbaI (4877) XhoI (5163) Hind III (804 5) Sa lI (6239 ) pBS II-KS + TK + 5'-Flanke + lacZ-Neo + 3'-Flanke lacZ-pA Ampicillin ATG ORF Bam HI (9572) Eco RV (9566) 19539 bp Not I (670) SpeI (9307) SpeI (677) Bam HI (683) Spe I (12422) BamHI (12416) Xba I (8222) Acc 65I (3235) Xho I (7936) pGK-Neomycin-pA Acc 65I (3661) SalI (6860) Xho I (5163) 3'-Flanke Acc 65I (4726) Acc 65I (5470) XhoI (5175) Not I (5182) XbaI (12428) NotI (12435) Xho I (7942) Not I + Spe I oder nur Spe I Ampicillin Afl III (8355) SalI (6866) Acc 65I (9788) Xho I (9773) Thymidine-Kinase Eco RI (7718) Bam HI (7712) Pvu I (9618) Ampicillin Pvu I (500) pBS II-KS + 3'-Flanke 10163 bp Not I (670) SpeI (683) pBS II-KS + TK + 5'-Flanke + lacZ-Neo.trunc 5'-Flanke Acc 65I (6590) Not I (670) 11994 bp ATG ORF Xba I (677) Xba I (5522) Bam HI (689) 3'-Flanke Acc 65I (5528) Fertiger KO-Konstruktvektor, der für die homologe Rekombination in ES-Zellen mit Not I linearisiert wurde. Pvu I (886) Afl III (2737) pGK-Neomycin-truncated Bam HI (5481) Spe I (1762) Bam HI (2027) Eco RI (2483) lacZ-pA
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Acc 65I (26)<br />
SmaI (22)<br />
ApaI (18)<br />
KpnI (12)<br />
Acc65I (8)<br />
BamHI (73)<br />
Sa cII (48)<br />
XbaI (32)<br />
Ligation:<br />
- 89 -<br />
5’…ATGGCTGAGGGTGAGGATATGCAGACCTTCACTTCCATCATGGATGCACTAGGTACCTCTAGAATGCA<br />
TTCCGCGGGTTTTCATGTACCCAGCATGGGGGATCCCGTCGTTTTA…3’<br />
Fortlaufendes Leseraster:<br />
5’…ATG.GCT.GAG.GGT.GAG.GAT.ATG.CAG.ACC.TTC.ACT.TCC.ATC.ATG.GAT.GCA.CTA.<br />
GGT.ACC.TCT.AGA.ATG.CAT.TCC.GCG.GGT.TTT.CAT.GTA.CCC.AGC.ATG.GGG.GAT.CCC<br />
.GTC.GTT.TTA…3’<br />
Hinzufügen der 3’-Flanke <strong>und</strong> Rekonstitution <strong>von</strong> Neomycin:<br />
KpnI (30)<br />
XbaI (32)<br />
Sa cII (48)<br />
lacZ-pA<br />
EcoR V (118 0)<br />
Thymidine-Kinase<br />
Bam HI (15257)<br />
5'-Flanke<br />
Acc 65I (14135)<br />
Acc 65I (13073)<br />
Xba I (13067)<br />
BamHI (73)<br />
Xho I (17318)<br />
SalI (17312)<br />
Eco RV (16688)<br />
EcoRV (16584)<br />
SacII (13057)<br />
Bam HI (13026)<br />
EcoRV (1180)<br />
lacZ-pA<br />
pGK-Neomycin-pA<br />
EcoRI (3071)<br />
pKC414-lacZ-Neo<br />
5207 bp<br />
pGK-Neomycin-pA<br />
BamH I (3527)<br />
pKC414-lacZ-Neo + 3'-Flanke<br />
1246 0 bp<br />
XbaI (4877)<br />
Sp e I (3792) Sp eI (5169)<br />
3'-Flanke<br />
Not I geschnitten + Spe I partiell verdaut<br />
alternativ ginge nur Spe I<br />
Eco RV (11923)<br />
Spe I (3792)<br />
BamHI (3527)<br />
Acc 65I (17333)<br />
SacII (664)<br />
XbaI (4877)<br />
XhoI (5163)<br />
Hind III (804 5)<br />
Sa lI (6239 )<br />
pBS II-KS + TK + 5'-Flanke<br />
+ lacZ-Neo + 3'-Flanke<br />
lacZ-pA<br />
Ampicillin<br />
ATG<br />
ORF<br />
Bam HI (9572)<br />
Eco RV (9566)<br />
19539 bp<br />
Not I (670)<br />
SpeI (9307)<br />
SpeI (677)<br />
Bam HI (683)<br />
Spe I (12422)<br />
BamHI (12416)<br />
Xba I (8222)<br />
Acc 65I (3235)<br />
Xho I (7936)<br />
pGK-Neomycin-pA<br />
Acc 65I (3661)<br />
SalI (6860)<br />
Xho I (5163)<br />
3'-Flanke<br />
Acc 65I (4726)<br />
Acc 65I (5470)<br />
XhoI (5175)<br />
Not I (5182)<br />
XbaI (12428)<br />
NotI (12435)<br />
Xho I (7942)<br />
Not I + Spe I<br />
oder nur Spe I<br />
Ampicillin<br />
Afl III (8355)<br />
SalI (6866)<br />
Acc 65I (9788)<br />
Xho I (9773)<br />
Thymidine-Kinase<br />
Eco RI (7718)<br />
Bam HI (7712)<br />
Pvu I (9618)<br />
Ampicillin<br />
Pvu I (500)<br />
pBS II-KS + 3'-Flanke<br />
10163 bp<br />
Not I (670)<br />
SpeI (683)<br />
pBS II-KS + TK + 5'-Flanke<br />
+ lacZ-Neo.trunc<br />
5'-Flanke<br />
Acc 65I (6590)<br />
Not I (670)<br />
11994 bp<br />
ATG<br />
ORF<br />
Xba I (677)<br />
Xba I (5522)<br />
Bam HI (689)<br />
3'-Flanke<br />
Acc 65I (5528)<br />
Fertiger KO-Konstruktvektor, der <strong>für</strong> <strong>die</strong><br />
homologe Rekombination in ES-Zellen mit Not I<br />
linearisiert wurde.<br />
Pvu I (886)<br />
Afl III (2737)<br />
pGK-Neomycin-truncated<br />
Bam HI (5481)<br />
Spe I (1762)<br />
Bam HI (2027)<br />
Eco RI (2483)<br />
lacZ-pA
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