Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
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Hinzufügen <strong>von</strong> β-Galactosidase-Enzym (lacZ) im fortlaufenden Leseraster <strong>und</strong> Neomycin-<br />
Resistenz:<br />
KpnI (9792)<br />
Xho I (9773)<br />
SalI (9767)<br />
Thymidine-Kinase<br />
Eco RI (7718)<br />
pBS II-KS + TK + 5’-Flanke<br />
Spe I geschnitten <strong>und</strong> mit<br />
Klenow-Enzym geblunted +<br />
Xba I geschnitten<br />
Ampicillin<br />
pBS II-KS + TK + 5'-Flanke<br />
+ lacZ-Neo.trunc<br />
5'-Flanke<br />
Start des Gens TRIM46 auf der genomischen Sequenz der 5’-Flanke:<br />
Das β-Galactosidase-Enzym (lacZ) wurde so<br />
geschnitten <strong>und</strong> mit Klenow-Enzym zubereitet,<br />
dass es bei der Klonierung in den Zielvektor an<br />
<strong>die</strong> 5’-Flanke im fortlaufenden Leseraster mit<br />
der dort beginnenden ko<strong>die</strong>renden Sequenz <strong>von</strong><br />
TRIM46 fusionierte. Der korrekte Übergang<br />
wurde durch Sequenzierung überprüft.<br />
5’…ATGGCTGAGGGTGAGGATATGCAGACCTTCACTTCCATCATGGATGCACTAGTCCGCATCAGT…3’<br />
Schnittstelle Spe I:<br />
5’…A^CTAG T…3’ => 5’…A blunt: 5’…ACTAG<br />
3’…T GATC^A…5’ …TGATC 3’…TGATC<br />
Anfang der lacZ-Sequenz in pKC414-lacZ-Neo:<br />
5’…GGGCCCCCCGGGGGTACCTCTAGAATGCATTCCGCGGGTTTTCATGTACCCAGCATGGGGGATCCCGT<br />
CGTTTTA…3’<br />
Schnittstelle Acc 65I:<br />
11994 bp<br />
ATG<br />
Not I (670)<br />
Xba I (677)<br />
Acc 65I (26)<br />
SmaI (22)<br />
ApaI (18)<br />
KpnI (12)<br />
Acc65I (8)<br />
pGK-Neomycin-truncated<br />
SpeI (1762)<br />
Acc 65I (9788) Bam HI (2027)<br />
SacI (8930)<br />
Bam HI (7712)<br />
SacI (7416)<br />
PvuI (11449)<br />
KpnI (6594)<br />
Acc 65I (6590)<br />
SacI (657)<br />
Pvu I (500)<br />
KpnI (5532)<br />
Acc 65I (5528)<br />
ORF<br />
PvuI (5370)<br />
Bam HI (5481)<br />
Xba I (5522)<br />
Eco RI (2483)<br />
SacI (3555)<br />
PvuI (3711)<br />
lacZ-pA<br />
Pvu I (4164)<br />
Pvu I (4644)<br />
Sa cII (4 8)<br />
BamHI (73)<br />
pKC414-lacZ-Neo<br />
β-Galactosidase-Enzym (lacZ) <strong>und</strong><br />
Neomycin-Resistenzgen wurden aus dem<br />
Vektor pKC414 durch Acc 65I <strong>und</strong> Xba I<br />
herausgeschnitten, wobei <strong>die</strong> Acc 65I-<br />
Schnittstelle mit Klenow-Enzym geblunted<br />
wurde.<br />
5’…G^GTAC C…3’ => GTACC…3’ blunt: GTACC…3’<br />
3’…C CATG^G…5’ G…5’ CATGG…5’<br />
KpnI (30)<br />
XbaI (32)<br />
lacZ-pA<br />
EcoRI (3071)<br />
5207 bp<br />
Sp eI (3792)<br />
BamHI (3527)<br />
pGK-Neomycin-pA<br />
Xba I (4877)<br />
XhoI (5163)<br />
Sp eI (5169 )<br />
XhoI (5175)<br />
EcoRV (1180) NotI (5182)
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