Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
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Pvu I (2416) Ampicillin - 86 - Ein Vorteil des Vektors pBS II-KS war das lacZ-Gen, welches die MCS überspannte und eine Blau/Weiß- Selektion auf erfolgreiche Klonierung eines Inserts erlaubte, da ein ausreichend großes Insert die Funktionsweise des lacZ-Gens stören sollte, so dass diese Kolonien unter Zusatz von x-gal weiß blieben statt blau zu werden. Das 3’-flankierende Ende wurde aus seinem entsprechenden λ-Phagen mit Xho I + Bam HI herausgetrennt. Dabei lagen beide Schnittstellen in dem Insert, so dass die MCS des λ-Phagen nicht weiter interessierte: pBS II-KS 2961 bp lacZ Xho I + Bam HI geschnitten Afl III (8355) KpnI (7961) Xho I (7942) SalI (6866) Pvu I (500) Afl III (1153) SacI (657) SpeI (683) Bam HI (689) MCS Kpn I (759) SalI (734) Xho I (740) Pvu I (9618) Ampicillin Xho I (234) pBS II-KS + 3'-Flanke KpnI (5480) 10163 bp Pvu I (500) SacI (657) SpeI (683) KpnI (4736) SacI (4407) HindIII (3116) 3'-Flanke λ-Phage-3’-Flanke Lambda-3'Flanke 3'-Flanke 10717 bp Bam HI (7487) Insert: 5’ Xho I - 7253bp – Bam HI 3’ Bam HI (689) Pvu I (886) Afl III (2737) SacI (3015) KpnI (3245) SacI (3327) KpnI (3671) EcoRI (10117) EcoRI (10127)
Pvu I (2416) Ampicillin Pvu I (4438) Ampicillin Afl III (3175) KpnI (2781) - 87 - Klonierung des KO-Konstruktes Ausgangspunkte für die Klonierung des KO-Konstruktes für das TRIM46-Gen waren die beiden in pBS II- KS-Vektoren vorliegenden flankierenden Fragmente des TRIM46-Genlokus aus den λ-Phagen, sowie die Vektoren pKO-Scrambler-NTK als Donor für die Thymidin-Kinase und der Vektor pKC414 als Donor für die Gene von lacZ und Neomycin-Resistenz. Zusammenfügen von Thymidin-Kinase und 5’-Flanke: Xho I (2762) SalI (2756) pBS II-KS 2961 bp Eco RI + Spe I geschnitten Afl III (5337) KpnI (4943) Xho I (4924) SalI (4918) Afl III (4645) Afl III (4495) lacZ Pvu I (500) Afl III (1153) SacI (657) SpeI (683) MCS Eco RV (715) SalI (734) KpnI (759) Eco RV blunt linearisiert pBS II-KS + TK Ampicillin Eco RV (4294) Eco RV (4190) 4983 bp Pvu I (6600) SacI (4081) Pvu I (500) SacI (657) Not I (670) Xba I (677) Spe I (683) Eco RI (707) Thymidine-Kinase SacI (1919) EcoRV (2028) Eco RV (2132) Afl III (2333) Afl III (2483) Afl III (1442) Afl III (1502) pBS II-KS + TK + 5'-Flanke Thymidine-Kinase 7145 bp SacI (657) Pvu I (500) Afl III (3664) Afl III (3604) Not I (670) Xba I (677) Spe I (683) Eco RI (2869) Afl III (1561) KpnI (1745) SacI (2567) 5'-Flanke Ampicillin Not I (3788) EcoRI (3750) Bam HI (3727) SpeI (3462) Ampicillin Afl III (3327) Pvu I (4590) KpnI (2933) Xho I (2914) pKO Scrambler NTK Vector 5608 bp Rsr II (3) Thymidine Kinase Rsr II (2022) Hin dIII (2069) Xho I (2091) Insert: Thymidin-Kinase Rsr II geschnitten und mit Klenow-Enzym geblunted. Richtige Orientierung musste nach der Ligation durch Sequenzierung oder Restriktionskartierung bestimmt werden. SalI (2908) Not I (2901) pBS II-KS + 5'-Flanke 5135 bp SacI (2567) Eco RI (2869) Insert: 5’ Eco RI - 2186bp – Spe I 3’ Pvu I (500) SacI (657) Not I (670) Spe I (683) Afl III (1561) KpnI (1745) 5'-Flanke
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Klonierung des KO-Konstruktes<br />
Ausgangspunkte <strong>für</strong> <strong>die</strong> Klonierung des KO-Konstruktes <strong>für</strong> das TRIM46-Gen waren <strong>die</strong> beiden in pBS II-<br />
KS-Vektoren vorliegenden flankierenden Fragmente des TRIM46-Genlokus aus den λ-Phagen, sowie <strong>die</strong><br />
Vektoren pKO-Scrambler-NTK als Donor <strong>für</strong> <strong>die</strong> Thymidin-Kinase <strong>und</strong> der Vektor pKC414 als Donor <strong>für</strong><br />
<strong>die</strong> Gene <strong>von</strong> lacZ <strong>und</strong> Neomycin-Resistenz.<br />
Zusammenfügen <strong>von</strong> Thymidin-Kinase <strong>und</strong> 5’-Flanke:<br />
Xho I (2762)<br />
SalI (2756)<br />
pBS II-KS<br />
2961 bp<br />
Eco RI + Spe I<br />
geschnitten<br />
Afl III (5337)<br />
KpnI (4943)<br />
Xho I (4924)<br />
SalI (4918)<br />
Afl III (4645)<br />
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lacZ<br />
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SacI (657)<br />
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Eco RV (715)<br />
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KpnI (759)<br />
Eco RV blunt linearisiert<br />
pBS II-KS + TK<br />
Ampicillin<br />
Eco RV (4294)<br />
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Pvu I (6600)<br />
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Not I (670)<br />
Xba I (677)<br />
Spe I (683)<br />
Eco RI (707)<br />
Thymidine-Kinase<br />
SacI (1919)<br />
EcoRV (2028)<br />
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Afl III (2333)<br />
Afl III (2483)<br />
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Afl III (1502)<br />
pBS II-KS + TK + 5'-Flanke<br />
Thymidine-Kinase<br />
7145 bp<br />
SacI (657)<br />
Pvu I (500)<br />
Afl III (3664)<br />
Afl III (3604)<br />
Not I (670)<br />
Xba I (677)<br />
Spe I (683)<br />
Eco RI (2869)<br />
Afl III (1561)<br />
KpnI (1745)<br />
SacI (2567)<br />
5'-Flanke<br />
Ampicillin<br />
Not I (3788)<br />
EcoRI (3750)<br />
Bam HI (3727)<br />
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Ampicillin<br />
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Xho I (2914)<br />
pKO Scrambler NTK Vector<br />
5608 bp<br />
Rsr II (3)<br />
Thymidine Kinase<br />
Rsr II (2022)<br />
Hin dIII (2069)<br />
Xho I (2091)<br />
Insert: Thymidin-Kinase Rsr II<br />
geschnitten <strong>und</strong> mit Klenow-Enzym<br />
geblunted. Richtige Orientierung<br />
musste nach der Ligation durch Sequenzierung<br />
oder Restriktionskartierung<br />
bestimmt werden.<br />
SalI (2908)<br />
Not I (2901)<br />
pBS II-KS + 5'-Flanke<br />
5135 bp<br />
SacI (2567)<br />
Eco RI (2869)<br />
Insert: 5’ Eco RI - 2186bp – Spe I 3’<br />
Pvu I (500)<br />
SacI (657)<br />
Not I (670)<br />
Spe I (683)<br />
Afl III (1561)<br />
KpnI (1745)<br />
5'-Flanke
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