Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
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λ-Phagen-PCR-Screen<br />
Um <strong>die</strong> DNA mit den flankierenden Sequenzen des TRIM46-Genlokus zu erhalten, wurde ein λ-Phagen-<br />
PCR-Screen (siehe Seite 170) mit Primern (siehe Seite 157) aus dem zu bestimmenden Bereich<br />
durchgeführt. Da <strong>die</strong> Größe der λ-Phagen begrenzt ist, wurde jeweils ein Ansatz <strong>für</strong> <strong>die</strong> 5’-Flanke <strong>und</strong><br />
einer <strong>für</strong> <strong>die</strong> 3’-Flanke durchgeführt <strong>und</strong> <strong>die</strong> Primer entsprechend aus <strong>die</strong>sen Bereichen gewählt. Am Ende<br />
wurden auch 2 überlappende λ-Phagen erhalten, <strong>die</strong> zur Kontrolle sequenziert wurden.<br />
Zur weiteren Verarbeitung wurden <strong>die</strong> Fragmente aus den λ-Phagen umkloniert in den Vektor pBS-KS, da<br />
<strong>die</strong>ser im Gegensatz zu den Phagen Ampicillin-Resistenz hatte <strong>und</strong> <strong>die</strong> Inserts somit in E. coli einfacher<br />
vervielfältigt werden konnten.<br />
Die Insert-Sequenzen lagen in<br />
der multiplen Klonierungsstelle<br />
(MCS) des λ-Phagen<br />
zwischen den Bam HI-Schnittstellen,so<br />
dass sie beispielsweise<br />
mit Not I vollständig<br />
herausgeschnitten werden<br />
konnten.<br />
Das 5’-flankierende Ende <strong>für</strong><br />
das KO-Konstrukt konnte mit<br />
Sal I + Spe I herausge-<br />
Abbildung 64: MCS des verwendeten λ-Phagens.<br />
schnitten werden, wobei zu beachten war, dass ein Teil <strong>von</strong> der MCS des λ-Phagens mitgenommen wurde,<br />
nämlich der zwischen Sal I <strong>und</strong> Bam HI mit den Schnittstellen Not I <strong>und</strong> Eco RI, <strong>die</strong> in der weiteren<br />
Klonierungsstrategie das Insert nicht versehentlich schneiden sollten. Es wurde in pBS II-KS eingefügt:<br />
Pvu I (2416)<br />
Ampicillin<br />
pBS II-KS<br />
2961 bp<br />
lacZ<br />
Spe I + Sal I geschnitten<br />
Ampicillin<br />
Pvu I (500)<br />
Afl III (1153)<br />
SacI (657)<br />
SpeI (683)<br />
MCS<br />
Kpn I (759)<br />
SalI (2908)<br />
SalI (734)<br />
BamHI (47)<br />
EcoRI (41)<br />
NotI (9)<br />
Sal I (2)<br />
pBS II-KS + 5'Flanke<br />
5135 bp<br />
SpeI (683)<br />
Afl III (1561)<br />
Afl III (3327) Kpn I (1745)<br />
Kpn I (2933)<br />
Pvu I (500)<br />
Pvu I (4590) SacI (657)<br />
SacI (2567)<br />
5'-Flanke<br />
5'-Flanke<br />
λ-Phage-5’-Flanke<br />
Lambda-Phage-5'-Flanke<br />
2596 bp<br />
Hind III (19 14 )<br />
Insert: 5’ Sal I - 2225bp – Spe I 3’<br />
Spe I (2227)<br />
BamHI (2398)
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