Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Herstellung einer Knock-out-Maus für das Gen TRIM46
Um der Funktion des TRIM46-Gens genauer nachspüren zu können, wurde eine Knock-out-Maus mit der
Methode der homologen Rekombination hergestellt, wobei nach dem abgebildeten Schema verfahren
wurde:
genomic locus of TRIM46
knockout construct
Thymidine Neomycine Kinase
mRNA of TRIM46
2.2 kbp
knockout genomic locus
LacZ fusion gene product instead of TRIM46 mRNA
ATG
ATG
ATG
lac Z
lac Z
3.6 kbp
11.7 kbp
AAAAAAAAA
AAAAAAAAA
Neomycine AMP resistence
Neomycine
7.2 kbp
Zuvor war die mRNA des TRIM46 Gens durch RT-PCR bestimmt (siehe Seite 53) und die Sequenz auf
das Maus-Genom projiziert worden, um die Größe des genomischen Lokus zu bestimmen. Dieser
umfasste die kodierende Region mit 11,7 kbp. Für die homologe Rekombination mussten die flankierenden
Regionen des Gens in ein Vektor-Konstrukt kloniert werden. Hierzu mussten die flankierenden
Regionen aus einem λ-Phagen-PCR-Screen gewonnen werden (siehe Seite 170, Primer siehe ab Seite
153). Die Größe des Homologiebereichs ist für die Effizienz des Rekombinationsereignisses wichtig
(Thomas and Capecchi 1987) und sollte etwa 10 kbp betragen. Die asymmetrische Größenverteilung (2,2
und 7,2 kbp) stellte keine Beeinträchtigung dar.
Für das Konstrukt wurde weiterhin die Sequenz für Neomycin-Resistenz samt Promotor kloniert, welche
die positive Selektion der ES-Zellen (embryonale Stammzellen der Maus) auf Integration des Konstruktes
nach der homologen Rekombination ermöglichte.
Zusätzlich wurde das bakterielle Enzym β-Galactosidase anstelle des TRIM46 in den Lokus kloniert unter
Berücksichtigung des fortlaufenden Leserahmens und Verwendung dessen ATG-Startsequenz, so dass
Gewebe in den späteren KO-Mäusen mittels x-Gal dort blau gefärbt werden konnten, an denen die β-
Galactosidase unter dem Promotor von TRIM46 an dessen Stelle exprimiert wurde.
Thymidin-Kinase in dem Konstrukt erfüllte die Funktion einer negativen Selektion auf ES-Zellen, die
zwar das Konstrukt integriert hatten, bei denen jedoch nicht die homologe Rekombination korrekt
abgelaufen war, so dass die Sequenz der Thymidin-Kinase hätte hinaus geschnitten werden müssen, da sie
außerhalb des homolog rekombinierbaren Bereiches lag. Damit sollten Zufallsintegrationen in das Genom
unterdrückt werden.
Die Ampicillin-Resistenz erlaubte die Vermehrung des Konstruktes in E. coli Bakterien und Selektion
nach erfolgreichen Zwischenschritten der Klonierungen.