Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

- 82 -
Die Primer für die Amplifikation der Inserts aus dem Hefevektor pJG4-5 wurden so gewählt, dass neben
den Inserts der cDNA-Bibliotheken auch das vom Vektor stammende initiale ATG zusammen mit
Kernlokalisationssequenz NLS und HA-Tag für Immunpräzipitation erhalten blieben.
Das GST-cDNA12-Fusionskonstrukt
im pGEX-KG-
Vektor wurde in E. coli
Bakterien des Stammes
BL21 DE3 C41 exprimiert
und als Protein über Glutathion-Affinitätschromatographie
(Siehe Seite 180)
aufgereinigt. Die Proteinmenge
des Eluats wurde
über Bradford bestimmt.
Aus 100 ml Bakteriensuspension
in der Sättigungsphase
wurden 1280 μg Protein
in 2 ml Volumen gewonnen.
Protein concentration [μg/μl]
2,2
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Bradford Assay of GST-affinity purified protein
Eichkurve BSA = 1 μg/μl
Eluat = 0,64 μg/μl
Eichkurve BSA = 2 μg/μl
Waschfraktion = 1,56 μg/μl
0,0
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50
Extinction 595nm
Für einen GST-Pulldown-Essay wurden 50 μg des gereinigten GST-cDNA12-Fusionsproteins eingesetzt
und mit Glutathion kovalent gebundener Agarose-Beads inkubiert. Für die Kontrollen wurde gereinigtes
GST-Protein mit den Glutathion-Agarose-Beads inkubiert. Zu diesen Inkubaten wurde per in-vitro-Transkription
und Translation hergestelltes 35 S-radioaktiv markiertes Proteinprodukt potentieller Interaktionspartner
von dem Yeast-Two-Hybrid-Screen gegeben und weiterinkubiert. Nichtbindende Proteine sollten
in Waschschritten entfernt werden, so dass nur solche übrig blieben, die tatsächlich mit TRIM46 aus der
cDNA12 interagierten. Diese gemeinsamen Eluate wurden per SDS-PAGE aufgetrennt und mit
Autoradiographie sichtbar gemacht.