Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Verifikation der Protein-Interaktionen mittels GST-Pulldown
Die mit Hilfe eines Yeast-Two-Hybrid-Screens gefundenen Protein-Interaktionspartner sollen im
Allgemeinen durch unabhängige Methoden abgesichert werden. Hierzu wurde der GST-Pulldown-Essay
eingesetzt (siehe Seite 180).
Die cDNA12 wurde aus
dem Hefevektor pEG202
umkloniert in den Vektor
pGEX-KG, der ein prokaryotischerExpressionsvektor
ist und das GST-Tag als
Fusionsprotein enthält, so
dass das Protein in E. coli
Bakterien des Stammes
BL21 DE3 C41 exprimiert
werden konnte. Der Vektor
pEG202 lässt sich zwar
auch in Bakterien vermehren,
exprimiert jedoch das
Protein nicht.
Zur Klonierung von cDNA12 in pGEX-KG wurde cDNA12 aus pEG202 mit Eco RI und Sal I
herausgeschnitten, dabei die Eco RI-Schnittstelle mit Klenow-Fragment blunt gemacht. Der Vektor
pGEX-KG wurde mit Xba I und Sal I geschnitten, wobei die Xba I-Schnittstelle mit Klenow-Enzym blunt
gemacht wurde. Auf diese Weise konnte cDNA12 im fortlaufenden Leseraster an den C-Terminus des
GST im pGEX-KG fusioniert werden (siehe Plasmid-Karte ab Seite 153).
Blunten der Eco RI-Schnittstelle von cDNA12:
G’AATT CATG… =>
5’
AATTCATG… =>
C TTAA’GTAC… 3’ GTAC…
Blunten der Xba I-Schnittstelle von pGEX-KG:
…ATT’CTAG A => …ATT 3’
…TAA GATC T …TAAGATC 5’
5’
AATTCATG…
3’
TTAACTAG…
=> …ATTCTAG 3’
…TAAGATC 5’
Blunt-End-Ligation von cDNA12 und pGEX-KG mit fortlaufendem Leseraster:
…ATT.CTA.G 3’
+
5’
AA.TTC.ATG… => …ATT.CTA.GAA.TTC.ATG…
+
3’
TT.AAC.TAG… => …TAA.GAT.CTT.AAC.TAG…
…TAA.GAT.C 5’
Das Klonierungsprodukt wurde zur Überprüfung sequenziert und enthielt den oben dargestellten korrekten
Übergang im Leseraster sowie keine Abweichungen zu der zuvor beschriebenen Sequenz (siehe Seite 75).
Die DNA-Sequenzen der potentiellen Interaktionspartner wurden aus dem Hefevektor pJG4-5 mittels PCR
herausamplifiziert (Primersequenzen siehe ab Seite 153), in pGEM-Teasy-Vektor zwischenkloniert und
über beidseitigen Not I-Verdau herausgeschnitten, sodann mittels Klenow-Enzym geblunted.
Die so erhaltenen Insert-Sequenzen wurden in den zuvor mit Hinc II blunt linearisierten und
dephosphorylierten (CIP-Enzym) pSP64-Vektor ligiert, wobei in 50% der Fälle eine korrekte Orientierung
zu erwarten war, die dann durch Restriktionsverdaue und Sequenzierung der Übergänge bestimmt wurde.