Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ... Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
cDNA4-GFP in NIH3T3 - 74 - 48 h 96 h 120 h 148 h 196 h cDNA12-GFP in NIH3T3 48 h 96 h 120 h 148 h 196 h Abbildung 60: Zeitreihe der Transfektion von cDNA4-GFP (obere Reihe) und cDNA12-GFP (untere Reihe) in NIH3T3-Zellen. Jede Spalte entspricht von links nach rechts einem der folgenden Zeitpunkte: 48, 96, 120, 148, 196 h. Es ist zu erkennen, dass das Fusionsprotein von TRIM46 in der Proteinisoform von cDNA4 zu allen Zeitpunkten vom Zellkern ausgeschlossen bleibt. Umgekehrt ist die Proteinisoform von cDNA12 schon früher als bei den Neuro2a-Zellen im Zellkern angereichert, wobei sich dieses mit der Zeit noch weiter verstärkt. Insgesamt hat die Transfektion der Konstrukte von cDNA4-GFP und cDNA12-GFP in den drei verschiedenen Zelllinien HeLa, Neuro2a und NIH3T3 konsistente Ergebnisse gebracht. Dabei wurde das Proteinprodukt von cDNA4 konsequent zu allen Zeiten von der Lokalisation im Zellkern ausgeschlossen, während sich das Proteinprodukt von cDNA12 bei HeLa-Zellen gleichverteilte zwischen Zellkern und Cytoplasma, bei den Neuro2a-Zellen mit der Zeit nach 148 h deutlich sichtbar werdend im Zellkern anreicherte und bei NIH3T3-Zellen dieses noch früher bereits nach 48 h passierte. Möglicherweise haben die verschiedenen Zelllinien unterschiedliche Geschwindigkeiten ihrer Kerntransportmaschinerie und vielleicht auch unterschiedliche Selektivitäten. Um zu Überprüfen, ob Phosphorylierung durch zelluläre Kinasen (Harbers, Nomura et al. 2001) wie Protein-Kinase C (PKC) einen Einfluss auf die Lokalisierung des TRIM46-Gens hat, wurden die oben dargestellten Zeitreihen-Experimente mit Zugabe von Staurosporin bzw. TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) durchgeführt, die jeweils den PKC-Signalpfad blocken bzw. aktivieren sollten. Dabei zeigten sich keine Unterschiede abgesehen von zunehmender Zytotoxizität aufgrund der zugesetzten Chemikalien, die jedoch auf TRIM46 transfizierte Zellen genauso wirkte wie auf Kontrollzellen. Die negativen Ergebnisse sind hier nicht weiter abgebildet.
- 75 - Suche nach Protein-Interaktionspartnern von TRIM46 mit Yeast-Two-Hybrid Um neben der deskriptiven Expressionsanalyse des TRIM46-Gens erste Hinweise auf die Funktion zu bekommen, wurden Protein-Interaktionspartner mittels Yeast-Two-Hybrid-Screen (siehe Seite 178) gesucht, da Gene der TRIM-Familie mit ihrer E3-Ubiquitin-Ligase-Funktionalität dafür bekannt sind, andere Proteine zu regulieren und dazu mit diesen zu interagieren. Beide Protein-Isoformen von TRIM46 wurden auf ihre Protein-Interaktionsfähigkeiten gegen die beiden cDNA-Bibliotheken von komplettem Mausembryo E19 und adultem Gehirn von OriGene getestet. Dazu wurden die beiden Splicevarianten cDNA4 und cDNA12 in den Bait-Vektor pEG202 mit fortlaufendem Leseraster kloniert. Da für das Proteinprodukt von CDNA4 keinerlei Proteininteraktionspartner gefunden wurden, sind im Folgenden nur die Ergebnisse von cDNA12 ausführlich dargestellt. Offenbar vermitteln die zusätzlichen Domänen von cDNA12 im Vergleich zu cDNA4 den Kontakt zu anderen Proteinen. Es wurde die Sequenz der cDNA12 (siehe Seite 53) von Position 10 bis 2189 in den Bait-Vektor pEG202 unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen Eco RI und Sal I (Überhänge in dem Alignment unten) kloniert. Dazu wurden diese Restriktionserkennungssequenzen an Primer (siehe Seite 153) gegen cDNA12 angehängt, das gereinigte Amplifikat in pGEM-Teasy-Vektor zwischenkloniert und durch Sequenzierung überprüft, alsdann mit Eco RI und Sal I ausgeschnitten und in pEG202 (siehe Seite 153) eingefügt. Alignment von unserer sequenzierten cDNA12 mit der vorhergesagten cDNA12 aus der Genomdatenbank Celera ergab einige abweichende Basen, die aber zu keiner Veränderung im ORF führten. Alignment von cDNA12 mit vorhergesagter cDNA12 aus Genomdatenbank mittels ClustalW:
- Seite 23 und 24: - 23 - Arterien verkleinern sich im
- Seite 25 und 26: - 25 - Abbildung 26: In frühen Sta
- Seite 27 und 28: - 27 - Abbildung 29: Klassifizierun
- Seite 29 und 30: Die TRIM-Proteine treten mit andere
- Seite 31 und 32: - 31 - • TRIM18: alias MID1. Asso
- Seite 33 und 34: Die Hybridisierungen wurden zweifac
- Seite 35 und 36: Zahl der Gene 25 20 15 10 5 0 - 35
- Seite 37 und 38: - 37 - Vorhersage neuer Marker-Gene
- Seite 39 und 40: - 39 - 90 IMAGp998I113134 Hippocamp
- Seite 41 und 42: E 14 - 41 - A B C Abbildung 41: In-
- Seite 43 und 44: E18 E14 Klon 149 - unbekanntes Gen
- Seite 45 und 46: - 45 - Die 3376 bp lange cDNA-Seque
- Seite 47 und 48: E 18 - 47 - M CGL M CGL M CGL A B C
- Seite 49 und 50: E18 E16 E14 - 49 - Positivkontrolle
- Seite 51 und 52: - 51 - Die Sequenz des IMAGE-Klons
- Seite 53 und 54: - 53 - Bestimmung von Splicevariant
- Seite 55 und 56: - 55 - ATGGGACTCTCATCTCACCAGCTGCATA
- Seite 57 und 58: - 57 - Übersicht der 8 Splicevaria
- Seite 59 und 60: Abbildung 53: 1 - 100 bp Marker 2 -
- Seite 61 und 62: - 61 - Haupt-Splicevariante 2 (enth
- Seite 63 und 64: - 63 - Auf der Seite davor sind Sta
- Seite 65 und 66: - 65 - In Übereinstimmung mit der
- Seite 67 und 68: - 67 - Die ProDom-Protein-Datenbank
- Seite 69 und 70: - 69 - Bei TRIM46 allerdings schien
- Seite 71 und 72: - 71 - “Neural Cell Adhesion Mole
- Seite 73: - 73 - Abbildung 57: Übersicht der
- Seite 77 und 78: - 77 - Die Abweichungen auf Baseneb
- Seite 79 und 80: Y13, Y57 Y18, Y65 Y23 Y153 Y159 Y16
- Seite 81 und 82: - 81 - Verifikation der Protein-Int
- Seite 83 und 84: - 83 - Resultate der GST-Pulldown-E
- Seite 85 und 86: - 85 - λ-Phagen-PCR-Screen Um die
- Seite 87 und 88: Pvu I (2416) Ampicillin Pvu I (4438
- Seite 89 und 90: Acc 65I (26) SmaI (22) ApaI (18) Kp
- Seite 91 und 92: - 91 - Verdaus von 5441 bp in zwei
- Seite 93 und 94: - 93 - Morula-Aggregation von ES-Ze
- Seite 95 und 96: - 95 - 2. Virtueller Northern für
- Seite 97 und 98: ISH - 97 - Abbildung 73: Die Abbild
- Seite 99 und 100: Abbildung 75: In der rechten Abbild
- Seite 101 und 102: cv ia da Abbildung 78: In diesem ho
- Seite 103 und 104: - 103 - Abbildung 82: E12ct Embryo
- Seite 105 und 106: ca na ok ct lca lca lca ct ct co ct
- Seite 107 und 108: le Il caa ia pe Il ila ao caa cav i
- Seite 109 und 110: 3 4 5 6 ia 7 8 9 10 11 12 13 1 2 ao
- Seite 111 und 112: tt Il ma de - 111 - Abbildung 94: I
- Seite 113 und 114: - 113 - TRIM46 im Whole-Mount-Gehir
- Seite 115 und 116: Abbildung 101: Adultes Gehirn von T
- Seite 117 und 118: Cgl Cgl TN GCl HI AMY AMY Pir Abbil
- Seite 119 und 120: - 119 - Genaue Lokalisation der TRI
- Seite 121 und 122: - 121 - Zur weiteren Spezifizierung
- Seite 123 und 124: Auge Magen, Duodenum, Pankreas, Dar
- 75 -<br />
Suche nach Protein-Interaktionspartnern <strong>von</strong> TRIM46 mit<br />
Yeast-Two-Hybrid<br />
Um neben der deskriptiven Expressionsanalyse des TRIM46-Gens erste Hinweise auf <strong>die</strong> Funktion zu<br />
bekommen, wurden Protein-Interaktionspartner mittels Yeast-Two-Hybrid-Screen (siehe Seite 178)<br />
gesucht, da Gene der TRIM-Familie mit ihrer E3-Ubiquitin-Ligase-Funktionalität da<strong>für</strong> bekannt sind,<br />
andere Proteine zu regulieren <strong>und</strong> dazu mit <strong>die</strong>sen zu interagieren.<br />
Beide Protein-Isoformen <strong>von</strong> TRIM46 wurden auf ihre Protein-Interaktionsfähigkeiten gegen <strong>die</strong> beiden<br />
cDNA-Bibliotheken <strong>von</strong> komplettem Mausembryo E19 <strong>und</strong> adultem Gehirn <strong>von</strong> OriGene getestet.<br />
Dazu wurden <strong>die</strong> beiden Splicevarianten cDNA4 <strong>und</strong> cDNA12 in den Bait-Vektor pEG202 mit<br />
fortlaufendem Leseraster kloniert. Da <strong>für</strong> das Proteinprodukt <strong>von</strong> CDNA4 keinerlei<br />
Proteininteraktionspartner gef<strong>und</strong>en wurden, sind im Folgenden nur <strong>die</strong> Ergebnisse <strong>von</strong> cDNA12<br />
ausführlich dargestellt. Offenbar vermitteln <strong>die</strong> zusätzlichen Domänen <strong>von</strong> cDNA12 im Vergleich zu<br />
cDNA4 den Kontakt zu anderen Proteinen.<br />
Es wurde <strong>die</strong> Sequenz der cDNA12 (siehe Seite 53) <strong>von</strong> Position 10 bis 2189 in den Bait-Vektor pEG202<br />
unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen Eco RI <strong>und</strong> Sal I (Überhänge in dem Alignment<br />
unten) kloniert. Dazu wurden <strong>die</strong>se Restriktionserkennungssequenzen an Primer (siehe Seite 153) gegen<br />
cDNA12 angehängt, das gereinigte Amplifikat in pGEM-Teasy-Vektor zwischenkloniert <strong>und</strong> durch<br />
Sequenzierung überprüft, alsdann mit Eco RI <strong>und</strong> Sal I ausgeschnitten <strong>und</strong> in pEG202 (siehe Seite 153)<br />
eingefügt.<br />
Alignment <strong>von</strong> unserer sequenzierten cDNA12 mit der vorhergesagten cDNA12 aus der Genomdatenbank<br />
Celera ergab einige abweichende Basen, <strong>die</strong> aber zu keiner Veränderung im ORF führten.<br />
Alignment <strong>von</strong> cDNA12 mit vorhergesagter cDNA12 aus Genomdatenbank mittels ClustalW:
Change language