Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

- 72 -
Subzelluläre Lokalisation des TRIM46-Gens
Die bioinformatische Annotation von Sequenzmotiven in den Exons des TRIM46-Gens (siehe Seite 50)
offenbarte zwei Exons mit Lokalisationssequenzen für den Zellkern. In den alternativen Splicevarianten
des TRIM46-Gens kamen diese Exons entweder beide vor oder eines von ihnen fehlte.
Zur Überprüfung der bioinformatischen Vorhersage für die subzelluläre Lokalisation, insbesondere also
der möglichen Lokalisation im Zellkern, wurden GFP-Fusionskonstrukte von den unterschiedlichen
Splicevarianten hergestellt (Sequenzen von cDNA12 und cDNA4 in den Vektor pEGFP-N2 im Leseraster
mit dem enthaltenen EGFP kloniert) und in Zellkultur transfiziert. Da die verschiedenen Splicevarianten
nach Translation zu nur 2 verschiedenen Protein-Isoformen führen – die anderen Splicevarianten sind
redundant oder im nicht-kodierenden Bereich bzw. erzeugen trunkierte Proteine – genügte die Analyse
von 2 Splicevarianten für diese beiden Protein-Isoformen. Die Fusion an GFP erfolgte dabei an dessen N-
Terminus, so dass der 3’UTR von TRIM46 abgeschnitten wurde und das TRIM46-Protein C-terminal an
GFP fusioniert wurde.
Die Transfektion erfolgte in NIH3T3-Zellen, HeLa-Zellen und die Zelllinie Neuro2a (siehe Seite 160).
Das Ergebnis war am deutlichsten in den NIH3T3-Zellen zu sehen, da diese die größten Zellkörper und –
Kerne hatten.
cDNA12
• kodierender Bereich von 2.2 kbp
ab zweitem ATG aus Exon 1
(siehe ab Seite 52).
• 9 Domänen entsprechend ihren
Exons (siehe Seite 49).
• 2 bioinformatisch vorhergesagte
Kernlokalisationssequenzen
NLS in den Domänen 1 und 7
(siehe Seite 65).
cDNA4
• kodierender Bereich von 1.2 kbp
ab zweitem ATG aus Exon 1
(siehe ab Seite 18).
• 7 Domänen, wobei Domäne 7b
kleiner ist als 7a ohne deren
NLS.
• 1 bioinformatisch vorhergesagte
Kernlokalisationssequenz
NLS in Domänen 1 analog zu
cDNA12.
NLS NLS
1 2 3 4 5 6 7a 8 9
Abbildung 55: Expression von cDNA12-GFP-Fusionskonstrukt in
NIH3T3-Zellen zeigt Anreicherung im Zellkern. Da sich GFP von
sich aus nicht im Zellkern anreichern würde mangels Lokalisationssequenzen
und aufgrund seiner Größe, muss es durch aktiven
Transport über Erkennung von NLS dorthin gebracht worden sein.
NLS
1
2 3 4 5 6 7b
Abbildung 56: Expression von cDNA4-GFP-Fusionskonstrukt
in NIH3T3-Zellen zeigt Ausschluss aus dem
Zellkern und Lokalisation im Cytoplasma. Offenbar reicht
die eine verbliebene NLS in Domäne 1 alleine nicht aus,
um die Kernlokalisation zu bewirken.