Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
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Abbildung 53:<br />
1 – 100 bp Marker<br />
2 – RT-PCR-Produkt<br />
- 59 -<br />
Zur Übersicht ist noch mal ein kurzer Ausschnitt aus dem Genlokus <strong>von</strong> TRIM46 dargestellt:<br />
GAGGGACTGCAAAGCCCTTGCCACCCACTCCCGCCCATGTTCTGTTCATACACCCCCGCC<br />
TCCCCTTCCAGCGCGAGGAAGATACAGTCAGGGAGAAGACGAAAAGGCCGGAGCCCAGCA<br />
GGCCCCCCTGAATGGTGAGCCACTCGGTGGAGGCCAGCTGGCGGCTGTAGATCTGCATGC<br />
CAGCGAAGAGCAGCAGGGACAGGAGGGAGGACAGCGCCAAGGAGGTCCCGGTACCGACTA<br />
CTATAAATGAGAAAAAGAGTCAGGCTAAGATTCAGGCAGATTCACTCCGGAGCTTGGCTC<br />
ACCAACCACTTCCAAGTGACCCAGCCCCCACCCCACAGCGACCTCCAGGAACCACCCGGC<br />
CCTGCACACCCAAGTTCCCGCCTGTCCGGAGGAAATGCTAGTTCCCAGGACACGTCAGCT<br />
TTACCGAGGCTACGGAGAAAAGAGGACCACCCCAACGCCCACTCCCGCTAGAGCAGCCCG<br />
GGCATCCCGCCGGTGCGGTTACCCATCACGCCCCGTCCGTGGTCCAATCCGTGTCCCTGG<br />
AGAAAGAGGGGAGCCAAAGCCGGCGCGGTTGTCTGTACGCAGGCGTCGGGGCCAACGTGG<br />
ACTTGCTTTACTTCTTCCTCTACGCGCCTTGGGTGCAGCGCCCTCTTGTGGCAAGGAGGA<br />
AATAATGCTTCTAAGAGCATTCTAGGCCACCGCCCTGCTTGGTCTCCAGCCTTCTGTAGC<br />
CAAGGCATCTGCTGTCTCTCTGGACAAGCTGCACTCATCTTTCAGTCATGATCCCATGGC<br />
CTAGAGTCACCTGTGCCTTCATTGCTATTCATGTCATCTCCCGTACAACTTCCTCAGACC<br />
TCCCTGACCCACTATAATTGCCTCAACAACTCCCGAAGATATGTGCCACCCAAGATGTAG<br />
CACCGTCCACCTGGAGTTCTTCTTCTGAAACGAGCTTCGTGCTTTATGTGAGTAGTATGA<br />
CCAGGAATCGATGCAAGCTTCTAATAGGAGGAATGGTTCCTACCTCAAATACCCTCCATG<br />
TTACCCACCCCCTAGACCGCCTTTGGAGAACCACGTGGGAAGAACTATTTCCCACCCCCT<br />
ACCTCGACGGACGCAGTTCGAAGCTAGTCCCTGGAGCATGCGCAGTGACATCTCACCCTC<br />
CCCACCCCTCCCTTCACCCCACCCGGCTCCTGCATTAAGCCCCGGGTTCGCAGCAGCAGC<br />
CAGGATCGGGCACCCGGGGGCGGGCGGGCACAGTAGGGCCATGGCTGAGGGTGAGGATAT<br />
GCAGACCTTCACTTCCATCATGGATGCACTAGTCCGCATCAGTGTGAGTTAAGGTGGGGT<br />
CAAGGGGAAGGGAGGGGATGTAAAGGGTCGGGGCAAGCCAGACCCTTGAACAGGTGGGGG<br />
TCCAGGAAGAATATGGATTATAGAGAAGGGATTAGTTAAGACAGAAATGACTGGGAGGGC<br />
GGAGACGCAAGTGTGGAGGGATCCTGGGGACAGCCGAGTGGTGAGACTCCCGTTTGCTGG<br />
GGTGTAGGCAGCGAGAAGCTGCCCGGACCCAGCGGGTAGGCTTGGGGTAGCTGCCAGGCG<br />
TGCACCAGGGCTATGAGAAGGGGCATGTGTGAGCTTGGATGTTTTCCAAGAAACTGAGGA<br />
CAGGTGTGGCGGGGGGTGGGGTGGGGTGATGAAAAAACCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN<br />
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN<br />
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN<br />
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN<br />
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTCCCCCTCCCTCCCTCTCCCT<br />
CCCTCCTTTGTGTCAGCTGCGCCCCTGACCGGGATGGCTGCGAAGAGAGGGACCAAGGTG<br />
AGGTGTGGGGGTGGGGAATAGCCAGAAGACCCCTCACCAAAAGGGGGAGGGATACTTCCG<br />
GTGGGGAGGGGGCAGGTAGGCGGGGCGCTCCTTCCTCCCCCACCCTAGATTGAGCAAAGG<br />
GTTGAAACAGGCCGAATTTCTCCACCAGACTGGGCCTGATAGCTCTAGTATAGAAGGCAA<br />
AGAGAGATGGGTTGATTTGGGGAGACTGGAAGAAATAGAATTGAAGAATGGAGGATGGGT<br />
GCTGGGGCGCCGGCCAGTGCCCAGCCGGTTCAGAGAGCTAGCGCACCCTGGCCGCGGGGA<br />
GCAGTCATGCGTCTAAGGGTTGCTAGAGAAAGGGGCGGGGGACAACACCCAGCTGTAGAA<br />
TGGGTGGTGCCCTTGAAATAAATGCTATTAATCCAGAGATGGAGGGATGGAGACAGGTGA<br />
GGCGGGAGGACTGCCTGCCAGCACTGCTGCAGCGGGAGTGATGGGGGTGGGGCGCGATGG<br />
TGGGGGAGGCCAGAGCTCCAACTGTACCTTCTTGGTGGACCTTAAGCTCCCCAAGAGGGG<br />
CGCCGAAGCAGGAGACAGAGAGCTGGGGAGGTGTGTGAACCAACGAAGGCGGGTACTGGG<br />
CCAAAGCAGTAGGTAGCTTGTGCTGCCCTTCCTGGCAGCCAAGGGACCGGGCTGAGATTT<br />
GCCCAAGTGTCCTAGCTCTCACACAACCTCCTGGTCCCTCCACAGACAAGCATGAAGAAC<br />
ATGGAGAAGGAACTGCTGTGCCCAGTGTGCCAAGAGATGTACAAGCAGCCACTAGTGCTG<br />
CCTTGTACCCACAACGTGTGCCAGGCCTGTGCCCGGGAGGTTTTGGGCCAGCAGGGGTAC<br />
ATAGGCCATGGTGGGGATCCGAGTTCGGAGCCCACTTCTCCTGCTTCCACCCCTTCTACC<br />
CGCAGCCCCCGCCTCTCTCGGAGAACTCTCCCCAAGCCAGATCGCTTGGACCGGCTCCTT<br />
AAGTCAGGTGGGGCTGGGGCCTGTGGGATGGGGTGGGGATGTAGAAAGATGGAAGAGGGT<br />
Die erwartete Größe der amplifizierten DNA wurde durch Gel-<br />
Elektrophorese bestätigt. Das Fragment <strong>von</strong> 377 bp (links) konnte<br />
nur nach korrektem Splicen der beiden das Intron flankierenden<br />
Exons resultieren. Somit musste sich das Template <strong>für</strong> <strong>die</strong> PCR <strong>von</strong><br />
der mRNA ableiten. Wäre es hingegen genomische DNA gewesen,<br />
so hätte man eine Fragmentgröße <strong>von</strong> 1653 bp erwartet.<br />
Wäre <strong>die</strong> mRNA nicht tatsächlich länger als bis<br />
zu dem bisher angenommenen ATG, so hätte<br />
es mit <strong>die</strong>sen Primern keine Bande geben dürfen.<br />
Mögliche TATA-Box-Konsensus-Sequenz<br />
erkannt (Programm: Accelrys DS-Gene).<br />
Mögliches 5’-äußerstes ATG. In der Sequenz<br />
5’-jenseits vom bisher angenommenen ATG<br />
wurde der 5’-Primer gesetzt:<br />
TAGACCGCCTTTGGAGAACC (Gel unten<br />
links). Ein anderer 5’-Primer erweiterte <strong>die</strong><br />
Sequenz (Gel unten rechts):<br />
TGGAGAAAGAGGGGAGCCAAAG<br />
Exon 0: Umfasste den angenommenen<br />
Translationsstart mit dem ATG.<br />
Exon 0: Umfasste <strong>die</strong> durch PCR erweiterte<br />
Sequenz mit dem weiter upstream liegenden<br />
ATG. Ein noch früher upstream liegender<br />
Transkriptionsstart konnte nicht ausgeschlossen,<br />
jedoch auch nicht empirisch bestätigt<br />
werden.<br />
Exon 1: Hier wurde zum Überbrücken des<br />
Introns der reverse Primer gewählt:<br />
GCACACGTTGTGGGTACAAG<br />
(Primer-Sequenz revers komplementär zur<br />
abgebildeten Sequenz links).<br />
B 1 2 3<br />
Abbildung 52: Agarose-Gel, aufgetragen<br />
<strong>von</strong> links nach rechts: B-Marker, 1-, 2-<br />
Primer zwischen TATAA-Sequenz <strong>und</strong><br />
ATG, <strong>die</strong> nicht getan haben. 3- Primer<br />
zwischen TATAA <strong>und</strong> ATG, der das<br />
erwartete Produkt lieferte.
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