Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Von den beiden Formen cDNA12 und cDNA4 gab es Varianten mit verlängertem Exon 0, was zu einem
Stop-Codon in demselben führte, so dass hier kein sinnvolles Protein resultieren dürfte. Alternativ wäre es
möglich, dass ein zweites ATG in Exon 1 die Funktion für den ORF erfüllen könnte, um das Protein zu
ermöglichen.
cDNA14 wie cDNA12 aber mit alternativem Exon 0 und möglicher Benutzung eines alternativen ATGs :
ATG-Ex0lang--Ex1-Ex2----Ex3-Ex4---------Ex5-Ex6------Ex7a---Ex8-------Ex9(Stop)
ATG
alternatives ATG
Stop-Codon TGA (opal)
alternatives Stop-Codon TAA (ochre) alternatives Stop-Codon TAG (amber)
Für die 3 variablen Exons; Exon 0, Exon 7b und Exon 8 ergäben sich kombinatorisch 8 mögliche
Spliceformen: 2 x 2 x 2 = 8
Jedoch wurden die Varianten von cDNA12 bzw. cDNA14 ohne das Exon 8 bei den 24 sequenzierten
cDNAs nicht beobachtet, so dass hier 2 der 8 theoretisch möglichen Spliceformen nicht beobachtet
wurden, weshalb nur 6 empirisch belegt sind.
Bemerkenswert an Exon 7b ist seine atypische Splice-Donor-Stelle GCAAGT, die zwar in der Literatur
durchaus vorkommt, jedoch weit seltener (ca. 2%) als die Konsensus-Donor-Akzeptor-Paare GT-AG.
AGGCTGTGGCCACCGCGGACTCTGCTCCGGAGCACCCCAGGCAAGT
Diese Exon-Sequenz war neben der Maus auch im Menschen konserviert, so dass von einer funktionellen
Bedeutung auszugehen ist. Wenn sie vorhanden ist, führt das zu einem verkürzten Protein.
Bestimmung des 5’-Endes der mRNA von TRIM46 durch Intron-
Überbrückung
Bei der Bestimmung der Splicevarianten wurden Primer eingesetzt, denen eine Annahme von der Größe
der mRNA von TRIM46 zugrunde lag, die zum einen auf dem Northern-Blot basierte und zum anderen auf
der bioinformatischen Genvorhersage der Celera-Datenbank.
Als mit Fortschreiten der Genomprojekte weitere Sequenzdaten verfügbar wurden, konnte upstream des
bisher angenommenen ATGs ein weiteres ausgemacht werden, das in demselben ORF läge und diesen
verlängerte. Um zu testen, ob diese vorhergesagte genomische Sequenz tatsächlicher Bestandteil der
mRNA von TRIM46 und somit des Exons 0 wäre, wurde RT-PCR mit entsprechenden Primern gemacht.
Dabei wurde der Vorwärts-Primer jenseits in 5’-Richtung des bisherigen ATGs gesetzt und der reverse
Primer so gewählt, dass die PCR ein Intron zu überspannen hatte, also in Exon 1 positioniert. Das
Überspannen eines Introns war insofern bedeutsam, um sicherzustellen, dass das PCR-Produkt tatsächlich
von einer mRNA stammte und die Kontamination von genomischer DNA ausgeschlossen werden konnte.