Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

- 53 -
Bestimmung von Splicevarianten des TRIM46-Gens
Für spätere Experimente zur Analyse des TRIM46-Proteins (Bestimmung der subzellulären Lokalisation,
Yeast-Two-Hybrid-Screening) musste die von der mRNA abgeleitete cDNA kloniert werden. Dabei
konnten zugleich verschiedene Splicevarianten festgestellt werden.
Von verschiedenen Gewebeproben der Maus, insbesondere E18-Gehirn und Körper des Embryos, wurde
RNA mittels Trizol isoliert und davon die mRNA mit ihrem Poly-A-Ende über Poly-T + -Säulen
angereichert (siehe RNA-Techniken, ab Seite 177). Die RNA wurde mittels reverser Transkriptase in
cDNA umgeschrieben und durch RT-PCR amplifiziert (siehe Seite 172). Hierzu mussten Primer
eingesetzt werden, denen schon eine Annahme über die mögliche zu erwartende Größe der mRNA
zugrunde lag. Als Ausgangspunkt dienten hier die Größeninformationen aus dem Northern-Blot sowie die
Genvorhersage aus der genomischen Sequenz von der Celera-Datenbank.
Der Vorwärts-Primer begann mit dem 5’-Ende der Genvorhersage an dem ATG des
angenommenen Translationsstarts. Als Revers-Primer kamen zwei verschiedene aus
dem nicht-kodierenden Bereich des 3’-UTR zum Einsatz. Einer der Revers-Primer
wurde für die RT-Reaktion anstelle von Poly-T-Primern eingesetzt, um direkt in der
RT-Reaktion eine Anreicherung durch Genspezifität zu erzielen, anstelle blind alle
mRNAs zu vervielfältigen. Der zweite, sukzessive verschachtelte Primer wurde in der
PCR-Reaktion nach der RT-Reaktion eingesetzt, um zusammen mit dem 5’-Primer die
Spezifität für die Zielsequenz weiter zu erhöhen (Nested-PCR). Die genauen Primer-
Sequenzen siehe ab Seite 153. Die beiden zuletzt verwendeten Primer wurden von den
Restriktionsschnittstellen Bam HI und Not I flankiert, um die anschließende Klonierung
zu erleichtern.
Die isolierten und gereinigten PCR-Produkte wurden zuerst in pGEM-Teasy einkloniert
und dort sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden auf die durch die Genomprojekte
bekannten genomischen Sequenzen projiziert und die Exon-Intron-Muster
bestimmt.
Von 24 sequenzierten cDNA-Klonen ergaben sich dabei 8 verschiedene Splicevarianten für TRIM46,
die zu 6 verschiedenen Proteinisoformen führten, von denen 2 Klassen am Häufigsten vorkamen.
Ursache für die geringere Zahl der Proteinisoformen sind Unterschiede in nicht-kodierenden Bereichen.
Exon-Intron-Struktur auf der genomischen Sequenz:
Zur genauen Charakterisierung ist ein Ausschnitt der genomischen Sequenz des Genlokus von TRIM46
auf Chromosom 3 der Maus mit den markierten Exons dargestellt.
Konvention der Sequenz-Annotation:
B 1 2
Abbildung 51:
Ergebnis der RT-
PCR-Reaktion.
Agarose-Gel mit
B-Marker, 1-, 2-
RT-PCR-Produkte
verschiedener Gewebeproben.
• Gelber Textmarker für sequenzierte Exons der cDNAs.
• Rote Schrift für Sequenzen der Genvorhersage der Celera-Datenbank.
• Kursive Buchstaben markieren den Bereich der 5’- und 3’-Flanken, die für das spätere KO-
Konstrukt verwendet wurden.
• Splice-Donor- und Akzeptor-Stellen sowie ATG und Stop-Codons und Poly-A-Signale in fett.
• CpG-Inseln unterstrichen.