Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Northern-Blot-Analyse für das TRIM46-Gen
Hauptziel der Northern-Blot-Analyse war die empirische Überprüfung der aus den Gendatenbanken
vorhergesagten tatsächlichen Größe der mRNA des TRIM46-Gens, um den späteren Knock-out planen zu
können, da der auszuknockende Bereich die kodierende Region des Gens vollständig einschließen bzw.
die fusionierte β-Galactosidase im ersten Exon platziert werden sollte (siehe Herstellung der Knock-out-
Maus ab Seite 84).
Hierzu wurde Gewebe aus E18-Embryonen entnommen, die RNA extrahiert, die mRNA angereichert,
geblottet und mit einer radioaktiv markierten komplementären Sonde aus dem 3’-UTR (siehe IMAGE-
Klon des Vorkapitels) hybridisiert.
Körper
polyA+
TRIM46 GAPDH
Gehirn
polyA-
Gehirn
polyA+
3,6 kbp
1,2 kbp
Körper
polyA+
Gehirn
polyA-
Gehirn
polyA+
Die im Northern-Blot bestimmte Länge der mRNA von TRIM46 stimmt mit 3,6 kbp mit der Vorhersage
aus der Genomdatenbank überein. Zur Normierung wurde eine Sonde gegen das Housekeeping-Gen der
Glykolyse GAPDH auf demselben Blot mithybridisiert, dessen Größe bereits bekannt ist. Ein RNA-
Längenmarker wurde mit aufgetragen, der jedoch nicht direkt zu sehen ist, da nicht radioaktiv. Die
Banden wurden vorher unter UV-Licht angeschaut und mit Bleistift auf dem Blot markiert, so dass der
belichtete Röntgenfilm zur Größenbestimmung nur auf den Blot gelegt werden musste. Zusammenfassend
sind die aus dem Marker gewonnenen Größen neben dem belichteten Röntgenfilm eingetragen.
Der Intensitätsvergleich zwischen den Proben aus Gehirn und Körper lässt hier keine eindeutige
Schlussfolgerung zu, da zwar im Körper kein Signal von TRIM46-mRNA detektiert wurde, jedoch auch
das GAPDH-Signal wesentlich schwächer ausfällt als in der Präparation für das Gehirn. Somit bewahrt
das GAPDH-Signal vor einem Fehlschluss, da TRIM46 sehr wohl auch im Körper in bestimmten Geweben
vorkommt, wie die spätere Expressionsanalyse zeigt.
Die Spuren mit polyA+ enthalten angereicherte mRNA, während die Spuren mit polyA- die
vorausgehende gesamte RNA enthalten. Bei TRIM46 zeigt sich erwartungsgemäß eine deutliche
Anreicherung, wie es bei weniger abundanten mRNA-Spezies vorkommt. Hingegen fällt der Effekt bei
GAPDH kaum ins Gewicht, wie es bei sehr abundanten mRNA-Spezies passieren kann, wenn die
Affinitäts-Säule zur Anreicherung übersättigt wird.