Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ... Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
Inhaltsverzeichnis - 4 - ABKÜRZUNGEN, BEGRIFFSKLÄRUNG ............................................................................................. 7 DANKSAGUNG.......................................................................................................................................... 8 EINLEITUNG ............................................................................................................................................. 9 Allgemeine Embryogenese................................................................................................................................. 10 Gehirnentwicklung und Genese des cerebralen Cortex ...................................................................................... 11 Gemeinsamkeiten in der Entwicklung von Nerven und Blutgefäßen................................................................. 20 Anatomie des Blutgefäßsystems in der Embryonalentwicklung ........................................................................ 22 Allgemeine Eigenschaften der TRIM-Genfamilie.............................................................................................. 26 ERGEBNISSE ........................................................................................................................................... 32 DNA-MICROARRAY-SCREEN.................................................................................................................. 32 Vorhersage neuer Marker-Gene mit regionalisierter Expression im Cortex ...................................................... 37 In-situ-Hybridisierungen zur Überprüfung der Expressions-Vorhersagen......................................................... 40 Klon 137 – bisher uncharakterisiertes Gen Nse1 ........................................................................................... 40 Klon 149 – unbekanntes Gen......................................................................................................................... 43 Klon 103 – Gen Etv5 aka ERM...................................................................................................................... 46 Klon 133 – Gen Klf12 aka AP-2rep............................................................................................................... 48 Positivkontrolle – Klone 59 und 65 – Gen Nfi/x............................................................................................ 49 DAS GEN TRIM46 ALS KANDIDAT FÜR EINE DETAILLIERTE ANALYSE .................................................. 50 NORTHERN-BLOT-ANALYSE FÜR DAS TRIM46-GEN.............................................................................. 52 BESTIMMUNG VON SPLICEVARIANTEN DES TRIM46-GENS.................................................................... 53 Exon-Intron-Struktur auf der genomischen Sequenz:......................................................................................... 53 Übersicht der 8 Splicevarianten von TRIM46..................................................................................................... 57 Bestimmung des 5’-Endes der mRNA von TRIM46 durch Intron-Überbrückung ............................................. 58 PHYLOGENETISCHE POSITION VON TRIM46 IN DER TRIM-FAMILIE...................................................... 62 ANNOTATION DER PROTEIN-DOMÄNEN VON TRIM46............................................................................ 66 SUBZELLULÄRE LOKALISATION DES TRIM46-GENS .............................................................................. 72 SUCHE NACH PROTEIN-INTERAKTIONSPARTNERN VON TRIM46 MIT YEAST-TWO-HYBRID .................... 75 VERIFIKATION DER PROTEIN-INTERAKTIONEN MITTELS GST-PULLDOWN............................................. 81 HERSTELLUNG EINER KNOCK-OUT-MAUS FÜR DAS GEN TRIM46 ......................................................... 84 λ-Phagen-PCR-Screen........................................................................................................................................ 85 Klonierung des KO-Konstruktes ........................................................................................................................ 87 Gentransfer in ES-Zellen und ES Zell-Screen.................................................................................................... 91 Morula-Aggregation von ES-Zellen, Keimbahntransfer und Genotypisierung der transgenen Mäuse .............. 93 EXPRESSIONSANALYSE DES TRIM46-GENS............................................................................................ 94 TRIM46 in EST-Datenbanken (virtueller Northern)........................................................................................... 94 Abschätzung antigener Regionen des TRIM46-Proteins .................................................................................... 96 Expression im Whole-Mount-Embryo auf Organebene...................................................................................... 96 Vergleich von ISH, Immunfärbung und lacZ ................................................................................................ 96 TRIM46 Expression im gesamten Embryo verschiedener Entwicklungsstadien ......................................... 100 TRIM46 im Whole-Mount-Gehirn verschiedener Entwicklungsstadien ...................................................... 113 Genaue Lokalisation der TRIM46-Expression im Gehirn mittels ISH und lacZ-Färbungen auf Schnitten...... 116 Genaue Lokalisation der TRIM46-Expression im Embryo mittels lacZ-Färbungen auf Schnitten................... 119 Arterien........................................................................................................................................................ 119 Innenohr....................................................................................................................................................... 122 Auge ............................................................................................................................................................ 123 Magen, Duodenum, Pankreas, Darm ........................................................................................................... 123 Plexus choroideus ........................................................................................................................................ 124 Niere ............................................................................................................................................................ 125 Harnblase..................................................................................................................................................... 127 Herz ............................................................................................................................................................. 128
- 5 - Lunge........................................................................................................................................................... 128 Negativkontrollen zu den Expressionsfärbungen ............................................................................................. 129 PHÄNOTYP DES KNOCK-OUTS IM VERGLEICH ZUM WILDTYP .............................................................. 130 Veränderungen des Lungengewebes mit zunehmendem Alter......................................................................... 130 lacZ-Färbung in Tumorgewebe von TRIM46-KO ............................................................................................ 131 Veränderungen des Urins ................................................................................................................................. 131 Melanocytenwucherung auf der Gehirnoberfläche........................................................................................... 132 DISKUSSION .......................................................................................................................................... 133 Microarray-Analyse ermöglicht Identifizierung neuer Gene mit regionalisierter Expression im cerebralen Cortex der Maus zum Stadium E18,5 .......................................................................................................... 133 Verifizierung der Chip-Daten mittels ISH gibt eine erste Charakterisierung für neu gefundene Gene ....... 134 Auswahl des Gens TRIM46 zur detaillierteren Analyse .............................................................................. 138 ZUSAMMENFASSUNG......................................................................................................................... 147 MATERIALIEN UND METHODEN ................................................................................................... 149 MATERIALIEN........................................................................................................................................ 149 Chemikalien................................................................................................................................................. 149 Lösungen ..................................................................................................................................................... 150 Kits .............................................................................................................................................................. 152 Sonderzubehör ............................................................................................................................................. 152 Verwendete Plasmide, Marker, PCR-Primer, Oligonukleotid-Sonden, Antikörper .................................... 153 Verwendete Zelllinien ................................................................................................................................. 160 METHODEN............................................................................................................................................ 161 Herstellung einer transgenen Maus .................................................................................................................. 161 Präparation und mitotische Inaktivierung von Neomycin-resistenten Fibroblasten .................................... 161 Kultivierung embryonaler Stammzellen ...................................................................................................... 161 DNA-Transfer in embryonale Stammzellen durch Elektroporation ............................................................ 161 Selektion von ES-Zellen zur Gewinnung von Einzelklonen........................................................................ 162 Einfrieren und Auftauen von ES-Zellen ...................................................................................................... 162 Gewinnung von Morulae für die Morula-Aggregation................................................................................163 Vorbereitung von ES-Zellen für die Morula-Aggregation...........................................................................163 Aggregation der Morulae mit ES-Zellen ..................................................................................................... 163 Uterustransfer der Blastocysten in pseudoschwangere Empfängermäuse ................................................... 164 Chimären und Keimbahntransfer................................................................................................................. 164 Zellkultur-Techniken........................................................................................................................................ 164 Splitten von Zellen durch Trypsinisieren..................................................................................................... 164 Transfektion mit Lipofektamin2000 ............................................................................................................ 164 Affymetrix-Microarray-Screen......................................................................................................................... 165 Gewebe-Präparation und RNA-Isolation..................................................................................................... 165 cDNA-Synthese ........................................................................................................................................... 165 Synthese biotinylierter RNA und Ausbeuteberechnung ..............................................................................166 Fragmentierung der biotinylierten RNA...................................................................................................... 166 Herstellung der Hybridisierungskontrollen.................................................................................................. 167 Hybridisierung der Microarrays................................................................................................................... 167 Hybridisierungscocktail (300 µl):................................................................................................................ 167 Waschen und Färben der Microchips .......................................................................................................... 167 Scannen der Microarrays und Auswertung der Daten ................................................................................. 168 DNA-Techniken ............................................................................................................................................... 169 Herstellung elektrokompetenter Bakterien .................................................................................................. 169 DNA-Präparation......................................................................................................................................... 169 Transformation von E. coli durch Elektroporation ...................................................................................... 169 Transformation von E. coli durch Hitzeschock ........................................................................................... 169 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren in Lösung ......................................................................... 170 Phenol/Chloroform- und Chloroform-Extraktion ........................................................................................ 170 Ethanolfällung.............................................................................................................................................. 170
- Seite 1 und 2: Identifizierung und Charakterisieru
- Seite 3: Diese Arbeit wurde am Max-Planck-In
- Seite 7 und 8: - 7 - Abkürzungen, Begriffsklärun
- Seite 9 und 10: - 9 - Einleitung Ziel dieser Arbeit
- Seite 11 und 12: - 11 - Gehirnentwicklung und Genese
- Seite 13 und 14: - 13 - bleibt im rostralen und late
- Seite 15 und 16: - 15 - Die thalamischen Innervation
- Seite 17 und 18: - 17 - reguliert die Etablierung de
- Seite 19 und 20: - 19 - Neben dem Hippocampus ist di
- Seite 21 und 22: - 21 - Abbildung 17: Das Semaphorin
- Seite 23 und 24: - 23 - Arterien verkleinern sich im
- Seite 25 und 26: - 25 - Abbildung 26: In frühen Sta
- Seite 27 und 28: - 27 - Abbildung 29: Klassifizierun
- Seite 29 und 30: Die TRIM-Proteine treten mit andere
- Seite 31 und 32: - 31 - • TRIM18: alias MID1. Asso
- Seite 33 und 34: Die Hybridisierungen wurden zweifac
- Seite 35 und 36: Zahl der Gene 25 20 15 10 5 0 - 35
- Seite 37 und 38: - 37 - Vorhersage neuer Marker-Gene
- Seite 39 und 40: - 39 - 90 IMAGp998I113134 Hippocamp
- Seite 41 und 42: E 14 - 41 - A B C Abbildung 41: In-
- Seite 43 und 44: E18 E14 Klon 149 - unbekanntes Gen
- Seite 45 und 46: - 45 - Die 3376 bp lange cDNA-Seque
- Seite 47 und 48: E 18 - 47 - M CGL M CGL M CGL A B C
- Seite 49 und 50: E18 E16 E14 - 49 - Positivkontrolle
- Seite 51 und 52: - 51 - Die Sequenz des IMAGE-Klons
- Seite 53 und 54: - 53 - Bestimmung von Splicevariant
- 5 -<br />
Lunge........................................................................................................................................................... 128<br />
Negativkontrollen zu den Expressionsfärbungen ............................................................................................. 129<br />
PHÄNOTYP DES KNOCK-OUTS IM VERGLEICH ZUM WILDTYP .............................................................. 130<br />
Veränderungen des Lungengewebes mit zunehmendem Alter......................................................................... 130<br />
lacZ-Färbung in Tumorgewebe <strong>von</strong> TRIM46-KO ............................................................................................ 131<br />
Veränderungen des Urins ................................................................................................................................. 131<br />
Melanocytenwucherung auf der Gehirnoberfläche........................................................................................... 132<br />
DISKUSSION .......................................................................................................................................... 133<br />
Microarray-Analyse ermöglicht <strong>Identifizierung</strong> neuer Gene mit regionalisierter Expression im cerebralen<br />
Cortex der Maus zum Stadium E18,5 .......................................................................................................... 133<br />
Verifizierung der Chip-Daten mittels ISH gibt eine erste <strong>Charakterisierung</strong> <strong>für</strong> neu gef<strong>und</strong>ene Gene ....... 134<br />
Auswahl des Gens TRIM46 zur detaillierteren Analyse .............................................................................. 138<br />
ZUSAMMENFASSUNG......................................................................................................................... 147<br />
MATERIALIEN UND METHODEN ................................................................................................... 149<br />
MATERIALIEN........................................................................................................................................ 149<br />
Chemikalien................................................................................................................................................. 149<br />
Lösungen ..................................................................................................................................................... 150<br />
Kits .............................................................................................................................................................. 152<br />
Sonderzubehör ............................................................................................................................................. 152<br />
Verwendete Plasmide, Marker, PCR-Primer, Oligonukleotid-Sonden, Antikörper .................................... 153<br />
Verwendete Zelllinien ................................................................................................................................. 160<br />
METHODEN............................................................................................................................................ 161<br />
Herstellung einer transgenen Maus .................................................................................................................. 161<br />
Präparation <strong>und</strong> mitotische Inaktivierung <strong>von</strong> Neomycin-resistenten Fibroblasten .................................... 161<br />
Kultivierung embryonaler Stammzellen ...................................................................................................... 161<br />
DNA-Transfer in embryonale Stammzellen durch Elektroporation ............................................................ 161<br />
Selektion <strong>von</strong> ES-Zellen zur Gewinnung <strong>von</strong> Einzelklonen........................................................................ 162<br />
Einfrieren <strong>und</strong> Auftauen <strong>von</strong> ES-Zellen ...................................................................................................... 162<br />
Gewinnung <strong>von</strong> Morulae <strong>für</strong> <strong>die</strong> Morula-Aggregation................................................................................163<br />
Vorbereitung <strong>von</strong> ES-Zellen <strong>für</strong> <strong>die</strong> Morula-Aggregation...........................................................................163<br />
Aggregation der Morulae mit ES-Zellen ..................................................................................................... 163<br />
Uterustransfer der Blastocysten in pseudoschwangere Empfängermäuse ................................................... 164<br />
Chimären <strong>und</strong> Keimbahntransfer................................................................................................................. 164<br />
Zellkultur-Techniken........................................................................................................................................ 164<br />
Splitten <strong>von</strong> Zellen durch Trypsinisieren..................................................................................................... 164<br />
Transfektion mit Lipofektamin2000 ............................................................................................................ 164<br />
Affymetrix-Microarray-Screen......................................................................................................................... 165<br />
Gewebe-Präparation <strong>und</strong> RNA-Isolation..................................................................................................... 165<br />
cDNA-Synthese ........................................................................................................................................... 165<br />
Synthese biotinylierter RNA <strong>und</strong> Ausbeuteberechnung ..............................................................................166<br />
Fragmentierung der biotinylierten RNA...................................................................................................... 166<br />
Herstellung der Hybridisierungskontrollen.................................................................................................. 167<br />
Hybridisierung der Microarrays................................................................................................................... 167<br />
Hybridisierungscocktail (300 µl):................................................................................................................ 167<br />
Waschen <strong>und</strong> Färben der Microchips .......................................................................................................... 167<br />
Scannen der Microarrays <strong>und</strong> Auswertung der Daten ................................................................................. 168<br />
DNA-Techniken ............................................................................................................................................... 169<br />
Herstellung elektrokompetenter Bakterien .................................................................................................. 169<br />
DNA-Präparation......................................................................................................................................... 169<br />
Transformation <strong>von</strong> E. coli durch Elektroporation ...................................................................................... 169<br />
Transformation <strong>von</strong> E. coli durch Hitzeschock ........................................................................................... 169<br />
Konzentrationsbestimmung <strong>von</strong> Nukleinsäuren in Lösung ......................................................................... 170<br />
Phenol/Chloroform- <strong>und</strong> Chloroform-Extraktion ........................................................................................ 170<br />
Ethanolfällung.............................................................................................................................................. 170
Change language