Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

Mit Hilfe der Auswertungssoftware
von Affymetrix sowie eigenen Algorithmen
wurden die Gene nach ihren
Messwerten in Gruppen eingeteilt
(„geclustert“). Die höchste Priorität
erhielten jene Gene mit exklusiver Expression
in einer der Regionen über
einem Schwellenwert als Expressionsunterschied
(„Fold Change“) um den
Faktor 2 gegenüber allen anderen.
Zum Teil wurden Gene mit deutlich
größeren Werten gefunden (siehe Tabellen
später). Da bekannt ist, dass
viele Gene im Gehirn in Form von
Gradienten über verschiedene Hirnregionen
exprimiert werden, wurden in
der zweiten Prioritätsstufe solche Gene
erfasst, die in 2 benachbarten der
Hirnregionen besonders exprimiert
sind, wobei ein Fold Change von
Faktor 1,5 als Schwellenwert für das
zweite Gewebe vorgegeben wurde.
Das Clustern wurde fortgesetzt mit
Kriterien für 3 Regionen, 4, sowie
überhaupt gehirnspezifischen Genen,
die im Körper nicht vorkommen.
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Abbildung 39: Fluoreszenzbild der Microarrays nach dem Ablesen im
Laserscanner und die schematische Anordnung der Sonden („probe
pairs“) auf dem Array. Ein probe set repräsentiert ein Gen oder EST
und besteht aus 16-20 nicht redundanten probe pairs, welche
Teilsequenzen des Gens oder ESTs sind. Ein probe pair besteht aus
einer probe cell für die perfect match (PM) Sonde (25 bp Oligonukleotide,
die exakt komplementär zur Referenz-Gensequenz sind) und einer
probe cell für die korrespondierende mismatch (MM) Sonde (Negativkontrolle
mit 1 Basenpaar Abweichung). Eine probe cell besteht
wiederum aus Millionen von Oligonukleotiden.
Nach der Computerauswertung der Microarray-Daten wurden 126 neue Sequenzen für E14.0, 187
Sequenzen für E16.0 und 217 Sequenzen für E19 bzw. E18,5 erhalten, die spezifisch in einer bestimmten
Region des Cortex exprimiert sein sollten. Diese Gene wurden für die individuellen Einzelarbeiten
aufgeteilt, so dass in dieser Arbeit die Hälfte der aus dem Screen vom Stadium E19 bzw. E18,5 erhaltenen
Ergebnisse dargestellt ist.
Ziel des ganzen Screens war es, Hinweise auf neue Gene zu finden, die dann mit weiteren Techniken wie
ISH verifiziert und näher charakterisiert werden sollten, sowie eines dieser Gene für eine detailliertere
Analyse mittels einer transgenen Maus auszuwählen. Die Anforderungen an die statistische Sicherheit der
Microarray-Voraussagen waren daher begrenzt und der Screen erfüllte in erster Linie eine qualitative
Aussage statt einer genauen Quantifizierung. Hierfür hätte mit deutlich mehr Chips hybridisiert werden
müssen, um eine Statistik mit Fehlerabschätzung durchführen zu können. Tatsächlich erhielten wir eine
Übereinstimmung von den Microarray-Vorhersagen zu den Verifikationen mittels ISH von 70%. Mehr
dazu im Diskussionsteil.