Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
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Die Hybridisierungen wurden<br />
zweifach durchgeführt,<br />
da <strong>die</strong> Firma Affymetrix uns<br />
einen Satz der Chips (V1)<br />
geliefert hatte, bei dem sich<br />
ca. 25% der Gene als komplementär<br />
zur tatsächlichen<br />
Sequenz erwiesen hatten.<br />
Mit dem korrigierten Satz<br />
(V2) wiederholten wir <strong>die</strong><br />
Hybridisierungen.<br />
Die aus den Geweben<br />
gewonnene Gesamt-RNA<br />
wurde mit T7-oligo-dT Primern<br />
revers transkribiert.<br />
Die gereinigte cDNA wurde<br />
in-vitro-transkribiert mit T7-<br />
RNA-Polymerase <strong>und</strong> einem<br />
Gemisch <strong>von</strong> unmarkierten<br />
sowie markierten biotinylierten<br />
NTPs. Nach Größenfragmentierung<br />
wurde <strong>die</strong><br />
markierte cRNA <strong>von</strong> jedem<br />
Gewebe mit einem Set der<br />
Microarray-Chips hybridisiert<br />
(also 3 Arrays pro<br />
Gewebe).<br />
Die Arrays wurden in der<br />
GeneChip Fluidics Station<br />
400 gewaschen, gefärbt mit<br />
Streptavidin-Phycoerythrin<br />
(SAPE) <strong>und</strong> <strong>von</strong> einem<br />
Laserscanner bei 570 nm<br />
ausgelesen.<br />
Die Rohdaten wurden mit<br />
der Software Affymetrix<br />
Microarray Suite 4.0<br />
(Affymetrix) ausgewertet.<br />
Dabei wurden <strong>die</strong> Datensätze<br />
<strong>von</strong> jeder einem Gewebe<br />
entsprechenden Hybridisierung<br />
mit jedem anderen<br />
Gewebe abgeglichen, d.h.<br />
darauf normiert <strong>und</strong> <strong>die</strong> Expressionsunterschiede<br />
relativ<br />
bestimmt.<br />
- 33 -<br />
Hippocampus Somatosensorischer<br />
Cortex<br />
Kombinatorischer Vergleich zwischen allen isolierten Geweben<br />
Motorcortex 1<br />
Visueller Cortex 2<br />
Somatosens. C. 3<br />
Cingularer Cortex 4<br />
Hippocampus 5<br />
Körper<br />
DNA microarray<br />
E19.0 Gehirne<br />
Motorcortex<br />
Cingularer<br />
Cortex<br />
Isolation <strong>von</strong> totaler RNA<br />
AAAAAAAAA<br />
cDNA Synthese<br />
AAAAAAAAA<br />
AAAAAAAAA<br />
cDNA (dT) 24 T7 Promotor<br />
SAPE SAGE<br />
25mer Oligonukleotid<br />
1 Motorcortex<br />
2 Visueller Cortex<br />
3 Somatosens. C.<br />
4 Cingularer Cortex<br />
5 Hippocampus<br />
Körper<br />
Visueller Cortex<br />
Abbildung 38: Schema der Vorgehensweise <strong>für</strong> den Microarray-Screen. Aus<br />
Mausgehirnen des Stadium E19 wurden Gewebe der verschiedenen Hirnregionen<br />
isoliert, daraus RNA gewonnen, <strong>die</strong> spezifisch <strong>für</strong> mRNA zur Synthese <strong>von</strong> cDNA<br />
eingesetzt wurde. Die cDNA <strong>die</strong>nte als Template <strong>für</strong> <strong>die</strong> Herstellung <strong>von</strong> Biotin<br />
markierter cRNA, <strong>die</strong> an <strong>die</strong> Oligonukleotide auf den Microarray-Chips<br />
hybridisierte. An das Biotin konnte fluoreszierendes Streptavidin-Phycoerythrin<br />
binden, dessen Signal mit einem biotinylierten AK verstärkt wurde <strong>und</strong> am Ende<br />
<strong>von</strong> einem Laserscanner quantitativ ausgelesen wurde.<br />
h·ν<br />
Biotinylierter α-Streptavidin AK<br />
SAPE<br />
SAGE<br />
Biotin-markierte cRNA
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