Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
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Ergebnisse DNA-Microarray-Screen - 32 - Seit ihrer Entwicklung sind DNA-Microarrays zu einer außergewöhnlich leistungsfähigen Methode zum Studium von Genexpressionsmustern in Geweben und für Krankheiten auf molekularer Ebene geworden. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Analyse von Genexpressions-Profilen wie Differential Display (Liang and Pardee 1992), Subtraktive Hybridisierung (Diatchenko, Lau et al. 1996) und Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) (Velculescu, Zhang et al. 1995) liegt der herausragende Vorteil der DNA-Microarray-Technologie in der Möglichkeit zur simultanen Betrachtung tausender Gene in einem bestimmten Gewebe. Um neue Gene zu identifizieren, die in spezifischen Regionen des sich entwickelnden cerebralen Cortex der Maus exprimiert werden, führten wir in einem Team von 3 Gruppen zu je 2 Leuten einen Screen von 36000 Maussequenzen und ESTs mit DNA-Microarrays durch, wobei Gewebe aus fünf corticalen Regionen der Stadien E14,0 (vor dem Erreichen der thalamocorticalen Axone in die corticale Platte), E16,0 (nach dem Erreichen der thalamocorticalen Axone in die Subplatte) und E19 bzw. E18,5 (nach Invasion der thalamocorticalen Axone in die dichte corticale Platte) isoliert wurden. Jede Gruppe führte dabei die Experimente für jeweils eines der 3 Entwicklungsstadien durch. In der vorliegenden Arbeit betrifft das Stadium E18,5. Abbildung 37: Seitliche (oben) und mediale (unten) Ansicht des cerebralen Cortex der Maus. Ein Stück aus der Mitte der Anlagen für den späteren Motor- (M), somatosensorischen (So), visuellen (V), cingularen (Cg) Cortex sowie den Hippocampus (Hi) wurden isoliert und für den DNA-Microarray Screen verwendet. Neben den Hirngeweben wurde als Kontrolle embryonaler Körper ohne Gehirn, Rückenmark und Genitalien verwendet, um nicht-nervensystemspezifische Expression herausfiltern zu können (Restkörper). Es ist bekannt, dass Nervensystem und insbesondere männliche Geschlechtsorgane überlappende Gene besitzen. Um diese nicht zu verlieren, wurden daher auch die Genitalien entfernt. Für den Screen kamen die von der Firma Affymetrix kommerziell erhältlichen Chips mit Sequenzen des Maus-Transkriptoms zum Einsatz. Unter der Kennung MG_U74 wurde ein Set von 3 Microarrays verwendet, das 36000 Mausgene abdecken sollte. Der erste der 3 Chips, MG_U74A, beinhaltete ca. 6000 Sequenzen der Mouse UniGene Database, die bis zu dem Zeitpunkt funktionell charakterisiert waren sowie ca. 6000 ESTs. Die übrigen beiden Arrays, MG_U74B und MG_U74C, beinhalteten 24000 EST Sequenzen. M So V Cg Hi
Die Hybridisierungen wurden zweifach durchgeführt, da die Firma Affymetrix uns einen Satz der Chips (V1) geliefert hatte, bei dem sich ca. 25% der Gene als komplementär zur tatsächlichen Sequenz erwiesen hatten. Mit dem korrigierten Satz (V2) wiederholten wir die Hybridisierungen. Die aus den Geweben gewonnene Gesamt-RNA wurde mit T7-oligo-dT Primern revers transkribiert. Die gereinigte cDNA wurde in-vitro-transkribiert mit T7- RNA-Polymerase und einem Gemisch von unmarkierten sowie markierten biotinylierten NTPs. Nach Größenfragmentierung wurde die markierte cRNA von jedem Gewebe mit einem Set der Microarray-Chips hybridisiert (also 3 Arrays pro Gewebe). Die Arrays wurden in der GeneChip Fluidics Station 400 gewaschen, gefärbt mit Streptavidin-Phycoerythrin (SAPE) und von einem Laserscanner bei 570 nm ausgelesen. Die Rohdaten wurden mit der Software Affymetrix Microarray Suite 4.0 (Affymetrix) ausgewertet. Dabei wurden die Datensätze von jeder einem Gewebe entsprechenden Hybridisierung mit jedem anderen Gewebe abgeglichen, d.h. darauf normiert und die Expressionsunterschiede relativ bestimmt. - 33 - Hippocampus Somatosensorischer Cortex Kombinatorischer Vergleich zwischen allen isolierten Geweben Motorcortex 1 Visueller Cortex 2 Somatosens. C. 3 Cingularer Cortex 4 Hippocampus 5 Körper DNA microarray E19.0 Gehirne Motorcortex Cingularer Cortex Isolation von totaler RNA AAAAAAAAA cDNA Synthese AAAAAAAAA AAAAAAAAA cDNA (dT) 24 T7 Promotor SAPE SAGE 25mer Oligonukleotid 1 Motorcortex 2 Visueller Cortex 3 Somatosens. C. 4 Cingularer Cortex 5 Hippocampus Körper Visueller Cortex Abbildung 38: Schema der Vorgehensweise für den Microarray-Screen. Aus Mausgehirnen des Stadium E19 wurden Gewebe der verschiedenen Hirnregionen isoliert, daraus RNA gewonnen, die spezifisch für mRNA zur Synthese von cDNA eingesetzt wurde. Die cDNA diente als Template für die Herstellung von Biotin markierter cRNA, die an die Oligonukleotide auf den Microarray-Chips hybridisierte. An das Biotin konnte fluoreszierendes Streptavidin-Phycoerythrin binden, dessen Signal mit einem biotinylierten AK verstärkt wurde und am Ende von einem Laserscanner quantitativ ausgelesen wurde. h·ν Biotinylierter α-Streptavidin AK SAPE SAGE Biotin-markierte cRNA
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Ergebnisse<br />
DNA-Microarray-Screen<br />
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Seit ihrer Entwicklung sind DNA-Microarrays zu einer außergewöhnlich<br />
leistungsfähigen Methode zum Studium <strong>von</strong> Genexpressionsmustern<br />
in Geweben <strong>und</strong> <strong>für</strong> Krankheiten auf molekularer<br />
Ebene geworden. Im Vergleich zu anderen Methoden zur<br />
Analyse <strong>von</strong> Genexpressions-Profilen wie Differential Display<br />
(Liang and Pardee 1992), Subtraktive Hybridisierung<br />
(Diatchenko, Lau et al. 1996) <strong>und</strong> Serielle Analyse der<br />
Genexpression (SAGE) (Velculescu, Zhang et al. 1995) liegt der<br />
herausragende Vorteil der DNA-Microarray-Technologie in der<br />
Möglichkeit zur simultanen Betrachtung tausender Gene in<br />
einem bestimmten Gewebe.<br />
Um neue Gene zu identifizieren, <strong>die</strong> in spezifischen Regionen<br />
des sich entwickelnden cerebralen Cortex der Maus exprimiert<br />
werden, führten wir in einem Team <strong>von</strong> 3 Gruppen zu je 2 Leuten<br />
einen Screen <strong>von</strong> 36000 Maussequenzen <strong>und</strong> ESTs mit<br />
DNA-Microarrays durch, wobei Gewebe aus fünf corticalen Regionen<br />
der Sta<strong>die</strong>n E14,0 (vor dem Erreichen der thalamocorticalen<br />
Axone in <strong>die</strong> corticale Platte), E16,0 (nach dem Erreichen<br />
der thalamocorticalen Axone in <strong>die</strong> Subplatte) <strong>und</strong> E19<br />
bzw. E18,5 (nach Invasion der thalamocorticalen Axone in <strong>die</strong><br />
dichte corticale Platte) isoliert wurden. Jede Gruppe führte dabei<br />
<strong>die</strong> Experimente <strong>für</strong> jeweils eines der 3 Entwicklungssta<strong>die</strong>n<br />
durch. In der vorliegenden Arbeit betrifft das Stadium E18,5.<br />
Abbildung 37: Seitliche (oben) <strong>und</strong><br />
mediale (unten) Ansicht des cerebralen<br />
Cortex der Maus. Ein Stück aus der Mitte<br />
der Anlagen <strong>für</strong> den späteren Motor- (M),<br />
somatosensorischen (So), visuellen (V),<br />
cingularen (Cg) Cortex sowie den<br />
Hippocampus (Hi) wurden isoliert <strong>und</strong> <strong>für</strong><br />
den DNA-Microarray Screen verwendet.<br />
Neben den Hirngeweben wurde als Kontrolle embryonaler Körper ohne Gehirn, Rückenmark <strong>und</strong> Genitalien<br />
verwendet, um nicht-nervensystemspezifische Expression herausfiltern zu können (Restkörper). Es<br />
ist bekannt, dass Nervensystem <strong>und</strong> insbesondere männliche Geschlechtsorgane überlappende Gene<br />
besitzen. Um <strong>die</strong>se nicht zu verlieren, wurden daher auch <strong>die</strong> Genitalien entfernt.<br />
Für den Screen kamen <strong>die</strong> <strong>von</strong> der Firma Affymetrix kommerziell erhältlichen Chips mit Sequenzen des<br />
Maus-Transkriptoms zum Einsatz. Unter der Kennung MG_U74 wurde ein Set <strong>von</strong> 3 Microarrays<br />
verwendet, das 36000 Mausgene abdecken sollte. Der erste der 3 Chips, MG_U74A, beinhaltete ca. 6000<br />
Sequenzen der Mouse UniGene Database, <strong>die</strong> bis zu dem Zeitpunkt funktionell charakterisiert waren<br />
sowie ca. 6000 ESTs. Die übrigen beiden Arrays, MG_U74B <strong>und</strong> MG_U74C, beinhalteten 24000 EST<br />
Sequenzen.<br />
M<br />
So<br />
V<br />
Cg<br />
Hi
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