Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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- 188 - fachen seines Volumens an vorgekühltem 100% Ethanol versetzt. Nach mindestens 30 min Inkubation bei -70°C erfolgte Zentrifugation für 15 min unter maximaler Drehzahl. Der Überstand wurde verworfen und das sichtbare Pellet mit 70% Ethanol 2 Mal gewaschen sowie nach kurzer Trocknung mit 10-20 µl TE bei 37°C gelöst. Mit Hilfe der linearisierten Sonden-DNA wurde folgende Synthesereaktion angesetzt: Gesamtvolumen 20 µl, bestehend aus 1 µg DNA-Matrize + 2 µl 10x Transkriptionspuffer (Roche) + 2 µl 10x DIG RNA Markierungsmix (Roche) + 0,5 µl RNasin (40 U/ µl, Promega) + 1 µl T3, T7 oder Sp6 RNA Polymerase (Roche, 20 U/ µl) je nach Plasmid + x µl Wasser zur Kompensation des Gesamtvolumens. Der 10x Transkriptionspuffer hatte die Zusammensetzung: 0,4 M Tris-HCl, pH 8,0 + 60 mM MgCl2 + 100 mM DTT + 20 mM Spermidin. Der Transkriptionsansatz wurde für 2 h bei 37°C inkubiert. Es folgte ein 15 minütiger DNase-Verdau bei 37°C durch Zusatz von 2 U RQ1-DNase (20 U/µl, DNase war RNase frei, von Promega). Danach wurde die RNA durch Zugabe von 100 µl TE (pH 8) + 10 µl 4 M LiCl und 300 µl absolutem Ethanol für 2 h bei -70°C gefällt. Die RNA wurde in 100 µl TE gelöst und im Agarosegel auf ihre Integrität hin überprüft. Protokoll für ISH auf Cryo-Schnitten Die Cryo-Schnitte wurden von Ihren Lagerbedingungen bei -70°C für ca. 20 min auf RT gebracht bis die Kondensfeuchtigkeit verschwunden war. Nach der Umrandung mit einem hitzebeständigen Stift (ImmEdge Pen, Vector) wurden sie in gebackene Küvetten überführt und durchliefen die folgenden Schritte: 1. Tag: 15 min Fixierung in 4% PFA in PBS. 2x 5 min in PBS. 4-5 min Proteinase K (20 µg/ml) in 50 mM Tris-HCl, pH8 und 5 mM EDTA bei 37°C. 5 min 0,2% Glycin in PBS. 2x 5 min in PBS. 20 min Postfixierung in 4% PFA / PBS und 0,2% Glutaraldehyd. 2x 5 min in PBS. 2 h Prähybridisierung in Hybridisierungsmix bei 70°C. 3 min Denaturierung der RNA-Sonde bei 80°C, Zugabe zum Hybridisierungsmix. Hybridisierung ÜN bei 70°C in einer feuchten Kammer mit Formamid/SSC/Wasser. 2. Tag: 5 min 2x SSC, pH 4,5. 3x 30 min 2x SSC/50% Formamid bei 65°C. 2x 10 min KTBT. 2 h Blocken in Blocklösung. Inkubation ÜN mit anti-DIG-alkalischer Phosphatase, Fab-Fragmenten (Roche, 1:2000) in Blocklösung, 4°C. 3. Tag: 3x 5 min KTBT. 3x 30 min KTBT. 3x 5 min NTMT. Färben mit NBT/BCIP (1:50, Roche) in NTMT bei RT für mehrere Stunden, evtl. ÜN. 3x 5 min PBT. Eindeckeln mit Mowiol 4-88 (Kuraray Specialities Europe). Vor dem Eindeckeln wurden die Färbestärke und das Verhältnis des Signals zum Hintergrund verglichen und eventuell mit frischer Färbelösung weiter inkubiert bis es ausreichte.

Anhang - 189 - Literaturverzeichnis Accili, D., C. S. Fishburn, et al. (1996). "A targeted mutation of the D3 dopamine receptor gene is associated with hyperactivity in mice." Proc Natl Acad Sci U S A 93(5): 1945-9. Aernout Luttun, P. C. (2003). "De novo vasculogenesis in the heart." Cardiovascular Research(58): 378- 389. Ali Z. Chaudhry, G. E. L., and Richard M. Gronostajski (1997). "Expression Patterns of the Four Nuclear Factor I Genes During Mouse Embryogenesis Indicate a Potential Role in Development." Developmental Dynamics 208: 313–325. Anne Chotteau-Lelièvre, X. D., Hélène Pelczar, Pierre-Antoine Defossez and Yvan de Launoit (1997). "Differential expression patterns of the PEA3 group transcription factors through murine embryonic development." Oncogene 15(8): 937-952. Ashburner, M., C. A. Ball, et al. (2000). "Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium." Nat Genet 25(1): 25-9. Ashique, A. M., V. Kharazia, et al. (2006). "Localization of the scaffolding protein RACK1 in the developing and adult mouse brain." Brain Res 1069(1): 31-8. Bartlett, S. E., J. Enquist, et al. (2005). "Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors." Proc Natl Acad Sci U S A 102(32): 11521-6. Bayer SA, A. J. (1991). Neocortical Development, Raven Press. Beer, H. D., C. Munding, et al. (2002). "The estrogen-responsive B box protein: a novel regulator of keratinocyte differentiation." J Biol Chem 277(23): 20740-9. Beheshti, B., I. Braude, et al. (2003). "Chromosomal localization of DNA amplifications in neuroblastoma tumors using cDNA microarray comparative genomic hybridization." Neoplasia 5(1): 53-62. Bishop, K. M., J. L. Rubenstein, et al. (2002). "Distinct actions of Emx1, Emx2, and Pax6 in regulating the specification of areas in the developing neocortex." J Neurosci 22(17): 7627-38. Bouwmeester, T., S. Kim, et al. (1996). "Cerberus is a head-inducing secreted factor expressed in the anterior endoderm of Spemann's organizer." Nature 382(6592): 595-601. Braitenberg, S. (1998). Cortex: Statistics and Geometry of Neuronal Connectivity, Springer. Burwell, R. D., M. P. Witter, et al. (1995). "Perirhinal and postrhinal cortices of the rat: a review of the neuroanatomical literature and comparison with findings from the monkey brain." Hippocampus 5(5): 390-408. Cajal, R. y. (2000). Texture of the Nervous System of Man and the Vertebrates. Vienna. Cao, T., K. L. Borden, et al. (1997). "Involvement of the rfp tripartite motif in protein-protein interactions and subcellular distribution." J Cell Sci 110 ( Pt 14): 1563-71. Carmeliet, P. (2003). "Blood Vessels and Nerves: Common Signals, Pathways and Diseases." Nature Review Genetics 4: 710-720. Chiang, C., Y. Litingtung, et al. (1996). "Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function." Nature 383(6599): 407-13. Chu, P. H., P. Ruiz-Lozano, et al. (2000). "Expression patterns of FHL/SLIM family members suggest important functional roles in skeletal muscle and cardiovascular system." Mech Dev 95(1-2): 259- 65. Coelho, D. J., D. J. Sims, et al. (2005). "Cell type-specific and sexually dimorphic expression of transcription factor AP-2 in the adult mouse brain." Neuroscience 134(3): 907-19. Cook, M. J. (1965). The Anatomy of the Laboratory Mouse, M.R.C. Laboratory Animals Centre Carshalton, Surrey, England Academic Press.

Anhang<br />

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Literaturverzeichnis<br />

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associated with hyperactivity in mice." Proc Natl Acad Sci U S A 93(5): 1945-9.<br />

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