Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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fachen seines Volumens an vorgekühltem 100% Ethanol versetzt. Nach mindestens 30 min Inkubation bei
-70°C erfolgte Zentrifugation für 15 min unter maximaler Drehzahl. Der Überstand wurde verworfen und
das sichtbare Pellet mit 70% Ethanol 2 Mal gewaschen sowie nach kurzer Trocknung mit 10-20 µl TE bei
37°C gelöst.
Mit Hilfe der linearisierten Sonden-DNA wurde folgende Synthesereaktion angesetzt:
Gesamtvolumen 20 µl, bestehend aus 1 µg DNA-Matrize + 2 µl 10x Transkriptionspuffer (Roche) + 2 µl
10x DIG RNA Markierungsmix (Roche) + 0,5 µl RNasin (40 U/ µl, Promega) + 1 µl T3, T7 oder Sp6
RNA Polymerase (Roche, 20 U/ µl) je nach Plasmid + x µl Wasser zur Kompensation des
Gesamtvolumens.
Der 10x Transkriptionspuffer hatte die Zusammensetzung: 0,4 M Tris-HCl, pH 8,0 + 60 mM MgCl2 + 100
mM DTT + 20 mM Spermidin.
Der Transkriptionsansatz wurde für 2 h bei 37°C inkubiert. Es folgte ein 15 minütiger DNase-Verdau bei
37°C durch Zusatz von 2 U RQ1-DNase (20 U/µl, DNase war RNase frei, von Promega). Danach wurde
die RNA durch Zugabe von 100 µl TE (pH 8) + 10 µl 4 M LiCl und 300 µl absolutem Ethanol für 2 h bei
-70°C gefällt. Die RNA wurde in 100 µl TE gelöst und im Agarosegel auf ihre Integrität hin überprüft.
Protokoll für ISH auf Cryo-Schnitten
Die Cryo-Schnitte wurden von Ihren Lagerbedingungen bei -70°C für ca. 20 min auf RT gebracht bis die
Kondensfeuchtigkeit verschwunden war. Nach der Umrandung mit einem hitzebeständigen Stift
(ImmEdge Pen, Vector) wurden sie in gebackene Küvetten überführt und durchliefen die folgenden
Schritte:
1. Tag: 15 min Fixierung in 4% PFA in PBS.
2x 5 min in PBS.
4-5 min Proteinase K (20 µg/ml) in 50 mM Tris-HCl, pH8 und 5 mM EDTA bei 37°C.
5 min 0,2% Glycin in PBS.
2x 5 min in PBS.
20 min Postfixierung in 4% PFA / PBS und 0,2% Glutaraldehyd.
2x 5 min in PBS.
2 h Prähybridisierung in Hybridisierungsmix bei 70°C.
3 min Denaturierung der RNA-Sonde bei 80°C, Zugabe zum Hybridisierungsmix.
Hybridisierung ÜN bei 70°C in einer feuchten Kammer mit Formamid/SSC/Wasser.
2. Tag: 5 min 2x SSC, pH 4,5.
3x 30 min 2x SSC/50% Formamid bei 65°C.
2x 10 min KTBT.
2 h Blocken in Blocklösung.
Inkubation ÜN mit anti-DIG-alkalischer Phosphatase, Fab-Fragmenten (Roche, 1:2000) in
Blocklösung, 4°C.
3. Tag: 3x 5 min KTBT.
3x 30 min KTBT.
3x 5 min NTMT.
Färben mit NBT/BCIP (1:50, Roche) in NTMT bei RT für mehrere Stunden, evtl. ÜN.
3x 5 min PBT.
Eindeckeln mit Mowiol 4-88 (Kuraray Specialities Europe).
Vor dem Eindeckeln wurden die Färbestärke und das Verhältnis des Signals zum Hintergrund verglichen
und eventuell mit frischer Färbelösung weiter inkubiert bis es ausreichte.