Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Protokoll für Cryo-Schnitte
Es wurde das ApopTag ® Kit S7160 der Firma Qbiogene verwendet.
Objektträger mit den Gewebeschnitten wurden aus -70°C Lagerung genommen und 20 min bei 37°C
trocknen gelassen.
Nachfixierung: 1% PFA in PBS für 10 min bei RT.
Waschen: 2 x 5 min PBS.
Permeabilisierung: Ethanol + Eisessig (2:1) für 5 min bei -20°C (vorgekühlt).
Waschen: 2 x 5 min PBS.
Pufferäquilibrierung: Die Objektträger wurden horizontal in einer feuchten Kammer ausgelegt und
Äquilibrationspuffer aus dem Kit aufgetropft und für 10-15 s inkubiert.
Enzymreaktion: Entfernung des Äquilibrationspuffers und Auftropfen der TdT-Enzymlösung
(700 μl Reaktionspuffer aus dem Kit + 300 μl TdT-Enzym auch daraus) für
1 h bei 37°C.
Stopp der Reaktion: Die Objektträger wurden in Küvetten mit Stop/Wash-Buffer aus dem Kit
inkubiert für 10 min bei RT und anfänglichem leichten Schütteln (15 s).
Waschen: 2 x 2 min PBS, eventuell Hoechst-Stain (1:1000) und nochmals 2 x 2 min PBS.
Die Objektträger wurden getrocknet, mit einigen Tropfen Vectashield H-1000 versehen und mit
Deckgläschen bedeckt.
In-situ-Hybridisierung von RNA-Sonden
Die verwendeten Tris-freien Lösungen wurden mit DEPC behandelt und anschließend autoklaviert, Tris
enthaltende Puffer nur autoklaviert. Es wurden RNase-freie Bedingungen eingehalten, d.h. Küvetten im
Ofen gebacken und Pipetten mit RNAzap (Ambion) gereinigt, ebenso der Arbeitsbereich. Die Sonden
wurden in Plasmidvektoren verwendet, die über T7-, SP6- oder T3-Promotoren verfügten, so dass mit den
entsprechenden Polymerasen cRNA synthetisiert werden konnte. Hierzu wurden die Fragmente mittels
PCR oder Restriktionsverdaue gewonnen und in solche Vektoren wie z.B. pGEM-Teasy kloniert.
Alternativ konnten bestellte Plasmide mit cDNA-Inserts von RZPD direkt verwendet werden.
Herstellung von Digoxigenin markierten RNA-Sonden
Die Plasmid-DNA musste mittels Restriktionsverdau einseitig linearisiert werden, um ein definiertes Ende
der cRNA-Synthese festzulegen und damit nicht zu viel Vektorsequenz in der zu synthetisierenden
Sondensequenz eingebaut wurde. Hierzu musste die Orientierung des Inserts in den Plasmiden mittels
Sequenzierung oder Restriktionsverdau bestimmt werden, so dass man die geeignete Polymerase für
„sense“ und „antisense“ auswählen konnte.
Ausgangsmenge für den Restriktionsverdau waren mindestens 10 μg DNA. Beispiel eines Restriktionsansatzes:
Gesamtvolumen 100 µl, 25-30 µg DNA, 20 U Restriktionsenzym, 10 µl Restriktionspuffer.
Nach 3-6 h Inkubation bei 37°C (je nach Enzym) wurde der Verdau im Gel auf Vollständigkeit mit
unverdauter DNA als Kontrolle kontrolliert. Bei unvollständiger Linearisierung wurden erneut 10 U
Enzym zugefügt. Nach vollständiger Linearisierung des Plasmids wurde die Reaktion durch Zugabe von 1
µl 0,5 M EDTA gestoppt und mit TE auf ein Gesamtvolumen von 200 µl aufgefüllt. Es erfolgte eine
Phe/Chl-Extraktion durch Zugabe von 200 µl Phenol/Chloroform, welches gemischt und bei 13000
Umdrehungen pro Minute in einer Tischzentrifuge 5 min lang getrennt wurde. Der Überstand wurde in ein
neues Gefäß überführt und mit 200 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) gemischt und wieder für 5 min
und 13000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde wieder in ein neues Gefäß überführt und zur
Präzipitation mit 1/25 seines Volumens an 7,5 M NH4Acetat (Endkonzentration 0,3 M) sowie dem 2,5