Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Protokoll für Paraffinschnitte mit Antigen-Unmasking
Antigen-Unmasking sollte die Zugänglichkeit von Antikörpern zu ihren Epitopen verbessern, indem es
PFA fixierte Proteine teilweise wieder aus ihrer Fixierung befreit, d.h. Crosslinks aufbricht.
In das vorherige Protokoll für Paraffinschnitte ohne Antigen-Unmasking wurden vor dem Blocking 3
Antigen-Unmasking-Inkubationen eingefügt. Während einer Antigen-Unmasking-Inkubation wurden die
Objektträger für 4 min in der Mikrowelle in der Antigen-Unmasking-Lösung gekocht und zwar auf der
kleinsten Intensitätsstufe, bei der noch ein Kochen zu beobachten war, danach 20 min abkühlen gelassen
bei RT. Es folgten 3 x 5 min in PBS zum Waschen und weiter im vorherigen Protokoll beim Blocking.
Protokoll für Whole-Mount-Immunfärbungen
Die Färbungen erfolgten hier nicht auf Schnitten, sondern möglichst intakt belassenen Embryonen.
Limitierender Faktor dieser Methode ist die Penetrierbarkeit der Antikörper in das Gewebe, was bei
Schnitten von wenigen μm Dicke nicht so problematisch ist. Je früher die verwendeten Embryonalstadien
waren, desto besser das Ergebnis. Embryonen ab Stadium E12 wurden mit einer Rasierklinge in kleinere
Teile zerlegt.
Waschen: Embryonen, welche zuvor ÜN in 4% PFA fixiert worden waren, wurden in 12 Well-
Plastikbehältern für 5 min mit PBT inkubiert, anschließend 5 min in Millipore-H2O.
Permeabilisierung:
Inkubation in vorgekühltem Aceton bei -20°C.
Waschen: 5 min in Millipore-H2O, anschließend 5 min in PBT.
Blocking: Inkubation für mindestens 1,5 h in Immunoblock-Lösung (5% Serum der Spezies des
sekundären AKs + 1% BSA + 1% DMSO in PBT).
Primär AK: Inkubation des primären AKs mit geeigneter Verdünnung (1:50-1:500) in
Immunoblock-Lösung bei 4°C ÜN.
Waschen: 7 x 15 min in Immunowasch-Lösung (1% BSA + 1% DMSO in PBT), anschließend
1 x 2 h in Immunowasch-Lösung.
Sekundär AK: Inkubation des sekundären AKs mit geeigneter Verdünnung (1:200) in
Immunoblock-Lösung bei 4°C ÜN.
Waschen: 8 x 15 min in Immunowasch-Lösung, anschließend 2 x 5 min in PBT.
Die Embryonen konnten in PBT bei 4°C längere Zeit gelagert und zur Fluoreszenzmikroskopie verwendet
werden.
Tunnel Staining gegen Apoptose
Tunnel Staining ist eine Nachweismethode für apoptotische Zellen, d.h.
Zellen, die einen programmierten Zelltod durchlaufen. Eine Nachweismethode
für das Labor ist das Tunnel Staining. Hier wird davon Gebrauch
gemacht, dass bei der Apoptose das Genom der Zellen in kleine
Fragmente von der Größe von Nucleosomen zerkleinert wird. Viele
kleine DNA-Fragmente bedeuten doppelt so viele Enden mit freien
3’OH-Gruppen. An diese können mit Hilfe des Enzyms Terminale
Desoxynucleotidyl-Transferase (TdT) freie Nukleotid-Triphoshpate, die
oft mit Digoxigenin markiert sind, angehängt werden unter Abspaltung
des Pyrophosphatrestes. Dies geht sowohl an doppelsträngiger wie
einzelsträngiger DNA und unabhängig von einem Template. Gegen das
Digoxigenin kann dann zur Sichtbarmachung mit einem fluorochromen
Antikörper gefärbt werden. Alternativ können die Nukleotid-Triphosphate
bereits mit einem Fluorochrom gekoppelt sein.