Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Immunhistochemische Färbungen
Die immunhistochemischen Färbungen dienten dem Nachweis von Protein-Expression in
Gewebeschnitten. Primäre Antikörper des Typs IgG aus einer bestimmten Tierspezies sollten spezifisch an
ihr Epitop, einer Teilsequenz des Zielproteins, binden. Ein sekundärer Antikörper wurde gegen die
invarianten Domänen (Heavy-Chain) der IgG-Antikörper aus der Spezies des primären Antikörpers
gerichtet. Der sekundäre Antikörper war mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Wurden primäre
Antikörper aus unterschiedlichen Spezies eingesetzt, so konnten mit spezies-spezifischen sekundären
Antikörpern, die mit verschiedenen Fluorochromen gekoppelt waren, Mehrfachfärbungen durchgeführt
werden, beispielsweise um die Co-Lokalisation bestimmter Proteine zu bestimmen.
Die unten dargestellten Protokolle konnten anhand der jeweiligen Antikörperverdünnungen variiert
werden. Auch die Veränderung der Blocking-Bedingungen hatte Einfluss auf das Ergebnis. Neben der
dargestellten allgemeinen Blocking-Lösung empfiehlt es sich, Blutserum aus der Spezies des Sekundär-
Antikörpers einzusetzen (ca. 1-5%), um unspezifische Bindungen zu minimieren.
Die Verwendung von Cryo- oder Paraffinschnitten erfolgte je nach Anforderungen für den Antikörper, da
manche nur auf bestimmten Gewebepräparationen funktionieren.
Protokoll für Cryo-Schnitte
Objektträger mit den Gewebeschnitten wurden aus -70°C Lagerung genommen und 20 min bei 37°C
trocknen gelassen.
Umrandung mittels Fettstift (ImmEdge Pen), um die Lösungen später auf dem Objektträger zu halten oder
um verschiedene Inkubationsbereiche mit Antikörperlösungen voneinander abzutrennen.
In Küvetten eingesetzt folgte Inkubation:
Waschen: 3 x 5 min in PBT.
Blocking: 1 h in Blockinglösung (0,2% Gelatine in PBT).
Primär AK: Verdünnung des primären AKs je nach Typ zwischen 1:50-1:500 in Blocking-Lösung.
Inkubation ÜN bei 4°C, nicht in Küvetten, sondern horizontal in feuchten Kammern,
um die Menge an AK-Lösungen zu minimieren (ca. 150-300 μl je nach Zahl der
Gewebeschnitte pro Objektträger, die durch den Fettstift auf dem Objektträger
gehalten wurden).
Waschen: 3 x 5 min in PBT.
Sekundär AK: Verdünnung des sekundären AKs je nach Typ bei 1:200 in Blockinglösung für 1 h
bei RT, ebenfalls wieder in feuchten Kammern statt Küvetten.
Waschen: 2 x 5 min PBT.
Gegenfärbung: Optional konnten die Zellkerne mit dem DNA-bindenden Farbstoff Hoechst (verdünnt
zu 1 x in PBS) für 5 min eingefärbt werden.
Waschen: 1 x 5 min PBS.
Die Objektträger wurden getrocknet, mit einigen Tropfen Vectashield H-1000 versehen und mit
Deckgläschen bedeckt.
Protokoll für Paraffinschnitte ohne Antigen-Unmasking
Objektträger mit den Gewebeschnitten wurden aus Lagerung bei RT genommen. Die Prozedur war
identisch mit der für Cryo-Schnitte bis auf folgende alternative Schritte zum Waschen und Rehydrieren
vor dem Blocking:
2 x 5 min in Histoclear.
Absteigende Ethanolreihe je 2 min in 100%, 96%, 90%, 70% Ethanol in Millipore-
H2O.
5 min in Millipore-H2O.
Weiter im Protokoll für Cryo-Schnitte mit Waschschritten in PBT vor Blocking.